ອົງປະກອບທາງເຄມີຂອງທໍ່ທໍ່ສະແຕນເລດ 304, ໂຄງສ້າງຂອງ SPACA6 ectodomain ປະກອບດ້ວຍທາດໂປຼຕີນທີ່ສະຫງວນໄວ້ຢູ່ໃນຄອບຄົວທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ fusion gamete.

ຂໍ​ຂອບ​ໃຈ​ທ່ານ​ສໍາ​ລັບ​ການ​ຢ້ຽມ​ຢາມ Nature.com​.ທ່ານກໍາລັງໃຊ້ເວີຊັນຂອງຕົວທ່ອງເວັບທີ່ມີການສະຫນັບສະຫນູນ CSS ຈໍາກັດ.ເພື່ອປະສົບການທີ່ດີທີ່ສຸດ, ພວກເຮົາແນະນຳໃຫ້ທ່ານໃຊ້ບຣາວເຊີທີ່ອັບເດດແລ້ວ (ຫຼືປິດການນຳໃຊ້ໂໝດຄວາມເຂົ້າກັນໄດ້ໃນ Internet Explorer).ນອກຈາກນັ້ນ, ເພື່ອຮັບປະກັນການສະຫນັບສະຫນູນຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ, ພວກເຮົາສະແດງເວັບໄຊທ໌ທີ່ບໍ່ມີຮູບແບບແລະ JavaScript.
ຕົວເລື່ອນສະແດງສາມບົດຄວາມຕໍ່ສະໄລ້.ໃຊ້ປຸ່ມດ້ານຫຼັງ ແລະປຸ່ມຕໍ່ໄປເພື່ອເລື່ອນຜ່ານສະໄລ້, ຫຼືປຸ່ມຄວບຄຸມສະໄລ້ຢູ່ທ້າຍເພື່ອເລື່ອນຜ່ານແຕ່ລະສະໄລ້.

SPACA6 ແມ່ນທາດໂປຼຕີນຈາກຫນ້າດິນທີ່ສະແດງອອກຂອງເຊື້ອອະສຸຈິທີ່ມີຄວາມສໍາຄັນສໍາລັບການລວມຕົວຂອງ gamete ໃນລະຫວ່າງການສືບພັນທາງເພດຂອງສັດລ້ຽງລູກດ້ວຍນົມ.ເຖິງວ່າຈະມີບົດບາດພື້ນຖານນີ້, ຫນ້າທີ່ສະເພາະຂອງ SPACA6 ແມ່ນເຂົ້າໃຈບໍ່ດີ.ພວກເຮົາ elucidate ໂຄງປະກອບການໄປເຊຍກັນຂອງ extracellular domain ຂອງ SPACA6 ທີ່ມີຄວາມລະອຽດ 2.2 Å, ເປີດເຜີຍທາດໂປຼຕີນຈາກສອງໂດເມນທີ່ປະກອບດ້ວຍມັດສີ່ສາຍແລະ Ig-like β-sandwiches ເຂົ້າຮ່ວມໂດຍຕົວເຊື່ອມຕໍ່ quasi-flexible.ໂຄງສ້າງນີ້ຄ້າຍຄືກັບ IZUMO1, ໂປຣຕີນທີ່ເຊື່ອມໂຍງກັນກັບ gamete ອີກອັນໜຶ່ງ, ເຮັດໃຫ້ສະມາຊິກຜູ້ກໍ່ຕັ້ງ SPACA6 ແລະ IZUMO1 ຢູ່ໃນຄອບຄົວຂອງໂປຣຕີນທີ່ຕິດພັນກັບການໃສ່ປຸ໋ຍທີ່ອ້າງເຖິງໃນທີ່ນີ້ວ່າເປັນ superfamily IST.IST superfamily ຖືກກໍານົດໂຄງສ້າງໂດຍມັດສີ່ helix ບິດຂອງມັນແລະຄູ່ຂອງ motifs CXXC ທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ disulfide.ການຄົ້ນຫາ AlphaFold ທີ່ອີງໃສ່ໂຄງສ້າງຂອງ proteome ຂອງມະນຸດໄດ້ກໍານົດສະມາຊິກທາດໂປຼຕີນເພີ່ມເຕີມຂອງ superfamily ນີ້;ໂດຍສະເພາະ, ຈໍານວນຫຼາຍຂອງທາດໂປຼຕີນເຫຼົ່ານີ້ແມ່ນມີສ່ວນຮ່ວມໃນ fusion gamete.ໂຄງສ້າງ SPACA6 ແລະຄວາມສໍາພັນຂອງມັນກັບສະມາຊິກອື່ນໆຂອງ superfamily IST ສະຫນອງການເຊື່ອມຕໍ່ທີ່ຂາດຫາຍໄປໃນຄວາມຮູ້ຂອງພວກເຮົາກ່ຽວກັບ mammalian gamete fusion.
ຊີວິດຂອງມະນຸດທຸກຄົນເລີ່ມຕົ້ນດ້ວຍສອງ gametes haploid ແຍກຕ່າງຫາກ: ເຊື້ອອະສຸຈິຂອງພໍ່ແລະໄຂ່ຂອງແມ່.ເຊື້ອອະສຸຈິນີ້ແມ່ນຜູ້ຊະນະຂອງຂະບວນການຄັດເລືອກທີ່ເຂັ້ມຂຸ້ນໃນໄລຍະທີ່ຈຸລັງອະສຸຈິຫຼາຍລ້ານຜ່ານທາງອະໄວຍະວະເພດຍິງ, ເອົາຊະນະອຸປະສັກຕ່າງໆ 1 ແລະ undergo capacitation, ເຊິ່ງເສີມຂະຫຍາຍການເຄື່ອນໄຫວຂອງເຂົາເຈົ້າແລະຂະບວນການຂອງອົງປະກອບຂອງຫນ້າດິນ2,3,4.ເຖິງແມ່ນວ່າເຊື້ອອະສຸຈິແລະ oocyte ຈະຊອກຫາກັນແລະກັນ, ຂະບວນການຍັງບໍ່ສິ້ນສຸດເທື່ອ.oocyte ຖືກອ້ອມຮອບດ້ວຍຊັ້ນຂອງຈຸລັງ cumulus ແລະອຸປະສັກ glycoprotein ທີ່ເອີ້ນວ່າ zona pellucida, ໂດຍຜ່ານທີ່ເຊື້ອອະສຸຈິຕ້ອງຜ່ານເຂົ້າໄປໃນ oocyte.Spermatozoa ໃຊ້ການປະສົມປະສານຂອງໂມເລກຸນການຍຶດຕິດຂອງຫນ້າດິນແລະ enzymes ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບເຍື່ອແລະ secreted ເພື່ອເອົາຊະນະອຸປະສັກສຸດທ້າຍເຫຼົ່ານີ້5.ໂມເລກຸນແລະ enzymes ເຫຼົ່ານີ້ສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນເກັບຮັກສາໄວ້ໃນເຍື່ອຫຸ້ມພາຍໃນແລະ acrosomal matrix ແລະຖືກກວດພົບເມື່ອເຍື່ອຊັ້ນນອກຂອງເຊື້ອອະສຸຈິຖືກ lysed ໃນລະຫວ່າງການຕິກິຣິຍາ acrosomal6.ຂັ້ນ​ຕອນ​ສຸດ​ທ້າຍ​ໃນ​ການ​ເດີນ​ທາງ​ທີ່​ເຂັ້ມ​ແຂງ​ນີ້​ແມ່ນ​ເຫດ​ການ fusion ເຊື້ອ​ອະ​ສຸ​ຈິ​, ໃນ​ທີ່​ທັງ​ສອງ​ຈຸ​ລັງ fuse ເຍື່ອ​ຂອງ​ເຂົາ​ເຈົ້າ​ໃຫ້​ກາຍ​ເປັນ​ອົງ​ການ​ດຽວ diploid7.ເຖິງແມ່ນວ່າຂະບວນການນີ້ແມ່ນພື້ນຖານໃນການສືບພັນຂອງມະນຸດ, ການໂຕ້ຕອບຂອງໂມເລກຸນທີ່ຈໍາເປັນແມ່ນເຂົ້າໃຈບໍ່ດີ.
ນອກເຫນືອໄປຈາກການໃສ່ປຸ໋ຍຂອງ gametes, ເຄມີຂອງ fusion ຂອງສອງ lipid bilayers ໄດ້ຖືກສຶກສາຢ່າງກວ້າງຂວາງ.ໂດຍທົ່ວໄປ, ການປະສົມປະສານຂອງເຍື່ອແມ່ນຂະບວນການທີ່ບໍ່ເອື້ອອໍານວຍຢ່າງແຂງແຮງທີ່ຕ້ອງການທາດໂປຼຕີນຈາກການປ່ຽນແປງຂອງໂຄງສ້າງທີ່ນໍາເອົາສອງເຍື່ອເຂົ້າໃກ້ກັນ, ທໍາລາຍຄວາມຕໍ່ເນື່ອງແລະເຮັດໃຫ້ເກີດ fusion8,9.catalysts ທາດໂປຼຕີນເຫຼົ່ານີ້ເປັນທີ່ຮູ້ຈັກເປັນ fusogens ແລະໄດ້ຖືກພົບເຫັນຢູ່ໃນລະບົບ fusion countless.ພວກມັນຕ້ອງການສໍາລັບການເຂົ້າສູ່ເຊນຂອງເຊື້ອໄວຣັດ (ເຊັ່ນ: gp160 ໃນ HIV-1, ການແຜ່ລະບາດຂອງໂຣກ coronaviruses, hemagglutinin ໃນໄວຣັດໄຂ້ຫວັດໃຫຍ່) 10,11,12 placental (syncytin)13,14,15 ແລະ fusions gamete-forming ໃນ eukaryotes ຕ່ໍາ ( HAP2/GCS1 ໃນພືດ, protists ແລະ arthropods) 16,17,18,19.Fusogens ສໍາລັບ gametes ຂອງມະນຸດຍັງບໍ່ທັນໄດ້ຖືກຄົ້ນພົບ, ເຖິງແມ່ນວ່າທາດໂປຼຕີນຈໍານວນຫນຶ່ງໄດ້ຖືກສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າມີຄວາມສໍາຄັນຕໍ່ການຕິດ gamete ແລະ fusion.oocyte-expressed CD9, ທາດໂປຼຕີນຈາກ transmembrane ທີ່ຈໍາເປັນສໍາລັບການ fusion ຂອງຫນູແລະ gametes ຂອງມະນຸດ, ເປັນຄັ້ງທໍາອິດທີ່ຖືກຄົ້ນພົບ 21,22,23.ເຖິງແມ່ນວ່າຫນ້າທີ່ຊັດເຈນຂອງມັນຍັງບໍ່ຊັດເຈນ, ບົດບາດໃນການຍຶດຫມັ້ນ, ໂຄງສ້າງຂອງ foci ຂອງການຕິດຢູ່ໃນ microvilli ໄຂ່, ແລະ / ຫຼືການທ້ອງຖິ່ນທີ່ຖືກຕ້ອງຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກຫນ້າດິນ oocyte ເບິ່ງຄືວ່າ 24,25,26.ທາດໂປຼຕີນຈາກປົກກະຕິສອງຊະນິດທີ່ມີຄວາມສໍາຄັນສໍາລັບ fusion gamete ແມ່ນທາດໂປຼຕີນຈາກເຊື້ອອະສຸຈິ IZUMO127 ແລະທາດໂປຼຕີນຈາກ oocyte JUNO28, ແລະການເຊື່ອມໂຍງເຊິ່ງກັນແລະກັນຂອງພວກມັນແມ່ນຂັ້ນຕອນສໍາຄັນໃນການຮັບຮູ້ gamete ແລະການຍຶດຫມັ້ນກ່ອນທີ່ຈະ fusion.ໜູຕົວ Izumo1 knockout ເພດຊາຍ ແລະ ໜູ Juno knockout ເພດຍິງແມ່ນເປັນໝັນຢ່າງສົມບູນ, ໃນຕົວແບບເຫຼົ່ານີ້ ເຊື້ອອະສຸຈິເຂົ້າໄປໃນຊ່ອງ perivitelline ແຕ່ gametes ບໍ່ປະສົມກັນ.ເຊັ່ນດຽວກັນ, confluence ໄດ້ຖືກຫຼຸດລົງເມື່ອ gametes ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ anti-IZUMO1 ຫຼື JUNO27,29 ພູມຕ້ານທານໃນການທົດລອງການຈະເລີນພັນຂອງມະນຸດໃນ vitro.
ບໍ່ດົນມານີ້, ກຸ່ມທີ່ຄົ້ນພົບໃຫມ່ຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ສະແດງອອກໂດຍເຊື້ອອະສຸຈິທີ່ມີລັກສະນະຄ້າຍຄືກັນກັບ IZUMO1 ແລະ JUNO20,30,31,32,33,34,35 ໄດ້ຖືກຄົ້ນພົບ.Sperm acrosomal membrane-associated protein 6 (SPACA6) ໄດ້ຖືກລະບຸວ່າເປັນສິ່ງຈໍາເປັນສໍາລັບການຈະເລີນພັນໃນການສຶກສາ murine mutagenesis ຂະຫນາດໃຫຍ່.ການໃສ່ transgene ເຂົ້າໄປໃນ gene Spaca6 ຜະລິດ spermatozoa ທີ່ບໍ່ແມ່ນ fusible, ເຖິງແມ່ນວ່າ spermatozoa ເຫຼົ່ານີ້ infiltrate perivitelline space 36 .ການສຶກສາ knockout ຕໍ່ມາໃນຫນູໄດ້ຢືນຢັນວ່າ Spaca6 ແມ່ນຕ້ອງການສໍາລັບ gamete fusion 30,32 .SPACA6 ແມ່ນສະແດງອອກເກືອບສະເພາະຢູ່ໃນ testes ແລະມີຮູບແບບການທ້ອງຖິ່ນຄ້າຍຄືກັນກັບ IZUMO1, ຄືພາຍໃນ intima ຂອງ spermatozoa ກ່ອນທີ່ຈະຕິກິຣິຍາ acrosomal, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນເຄື່ອນຍ້າຍໄປເຂດເສັ້ນສູນສູດຫຼັງຈາກຕິກິຣິຍາ acrosomal 30,32.Spaca6 homologues ມີຢູ່ໃນແນວພັນຂອງສັດລ້ຽງລູກດ້ວຍນົມແລະ eukaryotes ອື່ນໆ 30 ແລະຄວາມສໍາຄັນຂອງມັນສໍາລັບການ fusion gamete ຂອງມະນຸດໄດ້ຖືກສະແດງໃຫ້ເຫັນໂດຍການຍັບຍັ້ງການຈະເລີນພັນຂອງມະນຸດໃນ vitro ໂດຍການຕໍ່ຕ້ານ SPACA6 30 .ບໍ່ເຫມືອນກັບ IZUMO1 ແລະ JUNO, ລາຍລະອຽດຂອງໂຄງສ້າງ, ການໂຕ້ຕອບ, ແລະຫນ້າທີ່ຂອງ SPACA6 ຍັງບໍ່ຈະແຈ້ງ.
ເພື່ອໃຫ້ເຂົ້າໃຈໄດ້ດີຂຶ້ນກ່ຽວກັບຂະບວນການພື້ນຖານທີ່ຕິດພັນກັບເຊື້ອອະສຸຈິ ແລະໄຂ່ຂອງມະນຸດ, ເຊິ່ງຈະຊ່ວຍໃຫ້ພວກເຮົາແຈ້ງການພັດທະນາໃນອະນາຄົດໃນການວາງແຜນຄອບຄົວ ແລະ ການປິ່ນປົວການຈະເລີນພັນ, ພວກເຮົາໄດ້ເຮັດການສຶກສາໂຄງສ້າງ ແລະ ຊີວະເຄມີຂອງ SPACA6.ໂຄງປະກອບການໄປເຊຍກັນຂອງໂດເມນ extracellular ຂອງ SPACA6 ສະແດງໃຫ້ເຫັນເປັນມັດສີ່ helical (4HB) ແລະໂດເມນທີ່ຄ້າຍຄື immunoglobulin (Ig-like) ເຊື່ອມຕໍ່ໂດຍພາກພື້ນ quasi-flexible.ດັ່ງທີ່ຄາດຄະເນໄວ້ໃນການສຶກສາທີ່ຜ່ານມາ, 7,32,37 ໂຄງສ້າງໂດເມນຂອງ SPACA6 ແມ່ນຄ້າຍຄືກັນກັບ IZUMO1 ຂອງມະນຸດ, ແລະທາດໂປຼຕີນທັງສອງແບ່ງປັນເປັນ motif ຜິດປົກກະຕິ: 4HB ກັບຫນ້າດິນ helical ສາມຫຼ່ຽມແລະຄູ່ຂອງ disulfide-linked CXXC motifs.ພວກເຮົາສະເຫນີວ່າໃນປັດຈຸບັນ IZUMO1 ແລະ SPACA6 ກໍານົດເປັນຂະຫນາດໃຫຍ່, ໂຄງສ້າງ superfamily ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ superfamily ຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ fusion gamete.ການນໍາໃຊ້ຄຸນສົມບັດທີ່ເປັນເອກະລັກຂອງ superfamily, ພວກເຮົາໄດ້ດໍາເນີນການຄົ້ນຫາຢ່າງຄົບຖ້ວນສໍາລັບໂຄງສ້າງຂອງມະນຸດຂອງ AlphaFold, ການກໍານົດສະມາຊິກເພີ່ມເຕີມຂອງ superfamily ນີ້, ລວມທັງສະມາຊິກຈໍານວນຫນຶ່ງທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ gamete fusion ແລະ / ຫຼືການໃສ່ປຸ໋ຍ.ໃນປັດຈຸບັນມັນປະກົດວ່າມີພັບໂຄງສ້າງທົ່ວໄປແລະ superfamily ຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ fusion gamete, ແລະໂຄງສ້າງຂອງພວກເຮົາສະຫນອງແຜນທີ່ໂມເລກຸນຂອງລັກສະນະທີ່ສໍາຄັນຂອງກົນໄກການ fusion gamete ຂອງມະນຸດ.
SPACA6 ແມ່ນທາດໂປຼຕີນຈາກ transmembrane ຜ່ານດຽວທີ່ມີ glycan ເຊື່ອມຕໍ່ N ຫນຶ່ງແລະຫົກພັນທະບັດ disulfide putative (ຮູບ S1a ແລະ S2).ພວກເຮົາໄດ້ສະແດງໂດເມນ extracellular ຂອງມະນຸດ SPACA6 ( residues 27–246) ໃນຈຸລັງ Drosophila S2 ແລະ purified ທາດໂປຼຕີນໂດຍໃຊ້ nickel affinity, ການແລກປ່ຽນ cation, ແລະ chromatography ການຍົກເວັ້ນຂະຫນາດ (ຮູບ S1b).SPACA6 ectodomain ບໍລິສຸດແມ່ນມີຄວາມຫມັ້ນຄົງຫຼາຍແລະເປັນເອກະພາບ.ການວິເຄາະໂດຍໃຊ້ chromatography ການຍົກເວັ້ນຂະຫນາດລວມກັບການກະແຈກກະຈາຍແສງສະຫວ່າງ polygonal (SEC-MALS) ເປີດເຜີຍຫນຶ່ງຈຸດສູງສຸດທີ່ມີນ້ໍາຫນັກໂມເລກຸນທີ່ຄິດໄລ່ຂອງ 26.2 ± 0.5 kDa (ຮູບ S1c).ນີ້ແມ່ນສອດຄ່ອງກັບຂະຫນາດຂອງ SPACA6 monomeric ectodomain, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ oligomerization ບໍ່ໄດ້ເກີດຂຶ້ນໃນລະຫວ່າງການບໍລິສຸດ.ນອກຈາກນັ້ນ, spectroscopy dichroism ວົງກົມ (CD) ເປີດເຜີຍໂຄງສ້າງα/βປະສົມທີ່ມີຈຸດລະລາຍຂອງ 51.3 °C (ຮູບ S1d,e).Deconvolution ຂອງ CD spectra ເປີດເຜີຍ 38.6% α-helical ແລະ 15.8% β-stranded ອົງປະກອບ (ຮູບ S1d).
SPACA6 ectodomain ໄດ້ຖືກ crystallized ໂດຍໃຊ້ matrix seeding38 random ເຮັດໃຫ້ຊຸດຂໍ້ມູນທີ່ມີຄວາມລະອຽດ 2.2 Å (ຕາຕະລາງ 1 ແລະຮູບ S3).ການນໍາໃຊ້ການປະສົມປະສານຂອງການທົດແທນໂມເລກຸນທີ່ອີງໃສ່ຊິ້ນສ່ວນແລະຂໍ້ມູນໄລຍະ SAD ດ້ວຍການສໍາຜັດ bromide ສໍາລັບການກໍານົດໂຄງສ້າງ (ຕາຕະລາງ 1 ແລະຮູບ S4), ຮູບແບບການຫລອມໂລຫະສຸດທ້າຍປະກອບດ້ວຍສານຕົກຄ້າງ 27-246.ໃນເວລາທີ່ໂຄງສ້າງໄດ້ຖືກກໍານົດ, ບໍ່ມີໂຄງສ້າງທົດລອງຫຼື AlphaFold ທີ່ມີຢູ່.SPACA6 ectodomain ວັດແທກ 20 Å × 20 Å × 85 Å, ປະກອບດ້ວຍເຈັດ helices ແລະເກົ້າ β-strands, ແລະມີ fold tertiary elongated ສະຖຽນລະພາບໂດຍຫົກພັນທະບັດ disulfide (ຮູບ 1a, b).ຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງເອເລັກໂຕຣນິກທີ່ອ່ອນແອໃນຕອນທ້າຍຂອງຕ່ອງໂສ້ຂ້າງ Asn243 ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າສານຕົກຄ້າງນີ້ແມ່ນ glycosylation N-linked.ໂຄງສ້າງປະກອບດ້ວຍສອງໂດເມນ: N-terminal four-helix bundle (4HB) ແລະ C-terminal Ig-like domain with intermediate hinge region between them (ຮູບ 1c).
ໂຄງສ້າງຂອງໂດເມນ extracellular ຂອງ SPACA6.ແຜນວາດເສັ້ນດ່າງຂອງໂດເມນ extracellular ຂອງ SPACA6, ສີຂອງລະບົບຕ່ອງໂສ້ຈາກ N ຫາ C-terminus ຈາກສີຟ້າເຂັ້ມຫາສີແດງເຂັ້ມ.Cysteines ມີສ່ວນຮ່ວມໃນພັນທະບັດ disulfide ແມ່ນເນັ້ນໃສ່ໃນສີມ່ວງແດງ.b Topology ຂອງໂດເມນ extracellular ຂອງ SPACA6.ໃຊ້ຮູບແບບສີດຽວກັນກັບໃນຮູບ 1a.c SPACA6 ໂດເມນ extracellular.ຕາຕະລາງແຖບໂດເມນ 4HB, hinge, ແລະ Ig ຄ້າຍຄືສີສົ້ມ, ສີຂຽວ, ແລະສີຟ້າ, ຕາມລໍາດັບ.ຊັ້ນຂໍ້ມູນບໍ່ໄດ້ຖືກແຕ້ມເພື່ອປັບຂະຫນາດ.
ໂດເມນ 4HB ຂອງ SPACA6 ປະກອບມີສີ່ helices ຕົ້ນຕໍ (helices 1-4), ເຊິ່ງຖືກຈັດລຽງຢູ່ໃນຮູບແບບຂອງ helix helical (ຮູບ 2a), ສະລັບກັນລະຫວ່າງປະຕິສໍາພັນ antiparallel ແລະຂະຫນານ (ຮູບ 2b).helix ແບບດຽວເພີ່ມເຕີມຂະຫນາດນ້ອຍ (helix 1′) ຖືກວາງຕັ້ງຂວາງກັບມັດ, ປະກອບເປັນສາມຫຼ່ຽມທີ່ມີ helices 1 ແລະ 2. ສາມຫຼ່ຽມນີ້ແມ່ນຜິດປົກກະຕິເລັກນ້ອຍໃນການຫຸ້ມຫໍ່ helical-ບິດຂອງການຫຸ້ມຫໍ່ທີ່ຂ້ອນຂ້າງຫນາແຫນ້ນຂອງ helices 3 ແລະ 4 (. Fig. 2a).
4HB N-terminal strip chart.b ມຸມເບິ່ງເທິງສຸດຂອງມັດສີ່ອັນ, ແຕ່ລະ helix ເນັ້ນເປັນສີຟ້າເຂັ້ມຢູ່ປາຍ N ແລະສີແດງເຂັ້ມຢູ່ປາຍ C.c ແຜນວາດວົງລໍ້ກ້ຽວວຽນເທິງລົງລຸ່ມສໍາລັບ 4HB, ແຕ່ລະ residue ສະແດງໃຫ້ເຫັນເປັນວົງມົນທີ່ມີປ້າຍຊື່ດຽວລະຫັດອາຊິດ amino;ພຽງແຕ່ສີ່ອາຊິດ amino ຢູ່ເທິງສຸດຂອງລໍ້ແມ່ນຕົວເລກ.ທາດຕົກຄ້າງທີ່ບໍ່ມີຂົ້ວໂລກມີສີເຫຼືອງ, ທາດຕົກຄ້າງທີ່ບໍ່ມີຂົ້ວໂລກມີສີຂຽວ, ທາດຕົກຄ້າງທີ່ມີທາດສາກບວກແມ່ນສີຟ້າ, ແລະສານຕົກຄ້າງທີ່ຄິດຄ່າລົບແມ່ນສີແດງ.d ໃບຫນ້າສາມຫຼ່ຽມຂອງໂດເມນ 4HB, ມີ 4HBs ເປັນສີສົ້ມແລະ hinges ເປັນສີຂຽວ.ທັງສອງ insets ສະແດງໃຫ້ເຫັນພັນທະບັດ disulfide ຮູບ rod.
4HB ແມ່ນເຂັ້ມຂຸ້ນຢູ່ໃນແກນ hydrophobic ພາຍໃນປະກອບດ້ວຍສ່ວນຫຼາຍແມ່ນສານຕົກຄ້າງ aliphatic ແລະກິ່ນຫອມ (ຮູບ 2c).ຫຼັກປະກອບດ້ວຍພັນທະບັດ disulfide ລະຫວ່າງ Cys41 ແລະ Cys55 ທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ helices 1 ແລະ 2 ຮ່ວມກັນໃນສາມຫຼ່ຽມຍົກເທິງ (ຮູບ 2d).ສອງພັນທະບັດ disulfide ເພີ່ມເຕີມໄດ້ຖືກສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນລະຫວ່າງ motif CXXC ໃນ Helix 1′ ແລະ motif CXXC ອື່ນທີ່ພົບເຫັນຢູ່ປາຍຂອງ hairpin β-hairpin ໃນພາກພື້ນ hinge (ຮູບ 2d).ຕົກຄ້າງ arginine ແບບອະນຸລັກທີ່ມີໜ້າທີ່ທີ່ບໍ່ຮູ້ຈັກ (Arg37) ຕັ້ງຢູ່ພາຍໃນສາມຫຼ່ຽມຮູທີ່ສ້າງຂຶ້ນໂດຍ helices 1′, 1, ແລະ 2. ອະຕອມຄາບອນອາລີຟາຕິກ Cβ, Cγ, ແລະ Cδ Arg37 ມີປະຕິກິລິຍາກັບຫຼັກ hydrophobic, ແລະກຸ່ມ guanidine ຂອງມັນເຄື່ອນທີ່ໂດຍຮອບວຽນ. ລະຫວ່າງ helices 1′ ແລະ 1 ຜ່ານການໂຕ້ຕອບລະຫວ່າງກະດູກສັນຫຼັງ Thr32 ແລະຕ່ອງໂສ້ຂ້າງ (ຮູບ S5a, b).Tyr34 ຂະຫຍາຍເຂົ້າໄປໃນຮູຂຸມຂົນຊຶ່ງເຮັດໃຫ້ສອງຢູ່ຕາມໂກນຂະຫນາດນ້ອຍໂດຍຜ່ານທີ່ Arg37 ສາມາດພົວພັນກັບສານລະລາຍ.
Ig-like β-sandwich domains is a large superfamily of proteins that share the common feature of two or more multi-stranded amphipathic β-sheets interacting via a hydrophobic core 39. C-terminal Ig-like domain of SPACA6 ມີຮູບແບບດຽວກັນ. ແລະປະກອບດ້ວຍສອງຊັ້ນ (ຮູບ S6a).Sheet 1 ແມ່ນແຜ່ນເບຕ້າຂອງສີ່ສາຍ (strands D, F, H, ແລະ I) ບ່ອນທີ່ strands F, H, ແລະຂ້າພະເຈົ້າປະກອບເປັນການຈັດການຕ້ານການຂະຫນານ, ແລະ strands I ແລະ D ປະຕິບັດປະຕິສໍາພັນຂະຫນານ.ຕາຕະລາງ 2 ແມ່ນແຜ່ນເບຕ້າຕ້ານຂະໜານຂະໜາດນ້ອຍ (strands E ແລະ G).ພັນທະບັດ disulfide ພາຍໃນໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນລະຫວ່າງ C-terminus ຂອງຕ່ອງໂສ້ E ແລະສູນກາງຂອງລະບົບຕ່ອງໂສ້ H (Cys170-Cys226) (ຮູບ S6b).ພັນທະບັດ disulfide ນີ້ແມ່ນຄ້າຍຄືກັນກັບພັນທະບັດ disulfide ໃນໂດເມນ beta-sandwich ຂອງ immunoglobulin40,41.
ແຜ່ນເບຕ້າສີ່ເສັ້ນບິດຕາມລວງຍາວທັງໝົດຂອງມັນ, ປະກອບເປັນຂອບບໍ່ສະໝຳ່ສະເໝີເຊິ່ງມີຄວາມແຕກຕ່າງກັນໃນຮູບຮ່າງ ແລະ electrostatics.ຂອບບາງກວ່າແມ່ນພື້ນຜິວດ້ານສິ່ງແວດລ້ອມແບບ hydrophobic ຮາບພຽງທີ່ໂດດເດັ່ນເມື່ອປຽບທຽບກັບພື້ນຜິວທີ່ບໍ່ສະໝ່ຳສະເໝີ ແລະ ມີຄວາມຫຼາກຫຼາຍທາງໄຟຟ້າໃນ SPACA6 (ຮູບ S6b,c).halo ຂອງກະດູກສັນຫຼັງຂອງກຸ່ມ carbonyl/amino ທີ່ເປີດເຜີຍ ແລະຕ່ອງໂສ້ດ້ານຂົ້ວໂລກອ້ອມຮອບດ້ານ hydrophobic (ຮູບ S6c).ຂອບທີ່ກວ້າງກວ່າແມ່ນປົກຄຸມດ້ວຍສ່ວນທີ່ປົກຫຸ້ມດ້ວຍສ້ວຍທີ່ປິດກັ້ນສ່ວນ N-terminal ຂອງຫຼັກ hydrophobic ແລະປະກອບເປັນພັນທະບັດໄຮໂດຣເຈນສາມອັນກັບກຸ່ມຂົ້ວໂລກເປີດຂອງ F chain backbone (ຮູບ S6d).ສ່ວນ C-terminal ຂອງຂອບນີ້ປະກອບເປັນຖົງຂະຫນາດໃຫຍ່ທີ່ມີແກນ hydrophobic ເປີດເຜີຍບາງສ່ວນ.ກະເປົ໋າຖືກລ້ອມຮອບດ້ວຍຄ່າບວກເນື່ອງຈາກສາມຊຸດຂອງສານຕົກຄ້າງ arginine ສອງເທົ່າ (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 ແລະ Arg212-Arg214) ແລະ histidine ກາງ (His220) (ຮູບ S6e).
ພາກພື້ນ hinge ເປັນສ່ວນສັ້ນລະຫວ່າງໂດເມນ helical ແລະໂດເມນທີ່ຄ້າຍຄື Ig, ປະກອບດ້ວຍຫນຶ່ງ antiparallel ສາມຊັ້ນ β-stranded (strands A, B ແລະ C), ເປັນ helix ຂະຫນາດນ້ອຍ 310, ແລະພາກສ່ວນ helical Random ຍາວຫຼາຍ.(ຮູບ S7).ເຄືອຂ່າຍຂອງການຕິດຕໍ່ covalent ແລະ electrostatic ໃນພາກພື້ນ hinge ປະກົດວ່າສະຖຽນລະພາບການປະຖົມນິເທດລະຫວ່າງ 4HB ແລະໂດເມນທີ່ຄ້າຍຄື Ig.ເຄືອຂ່າຍສາມາດແບ່ງອອກເປັນສາມສ່ວນ.ສ່ວນທໍາອິດປະກອບມີສອງ motifs CXXC (27CXXC30 ແລະ 139CXXC142) ທີ່ປະກອບເປັນຄູ່ຂອງພັນທະບັດ disulfide ລະຫວ່າງ β-hairpin ໃນ hinge ແລະ 1′ helix ໃນ 4HB.ສ່ວນທີສອງປະກອບມີປະຕິສໍາພັນ electrostatic ລະຫວ່າງໂດເມນທີ່ຄ້າຍຄື Ig ແລະ hinge.Glu132 ໃນ hinge ປະກອບເປັນຂົວເກືອກັບ Arg233 ໃນໂດເມນທີ່ຄ້າຍຄື Ig ແລະ Arg135 ໃນ hinge ໄດ້.ສ່ວນທີສາມປະກອບມີພັນທະບັດ covalent ລະຫວ່າງໂດເມນທີ່ຄ້າຍຄື Ig ແລະພາກພື້ນ hinge.ສອງພັນທະບັດ disulfide (Cys124-Cys147 ແລະ Cys128-Cys153) ເຊື່ອມຕໍ່ hinge loop ກັບ linker ທີ່ສະຖຽນລະພາບໂດຍການປະຕິສໍາພັນ electrostatic ລະຫວ່າງ Gln131 ແລະກຸ່ມທີ່ເຮັດວຽກຂອງກະດູກສັນຫຼັງ, ອະນຸຍາດໃຫ້ເຂົ້າເຖິງໂດເມນທີ່ຄ້າຍຄື Ig ທໍາອິດ.ຕ່ອງໂສ້.
ໂຄງສ້າງຂອງ SPACA6 ectodomain ແລະໂຄງສ້າງສ່ວນບຸກຄົນຂອງ 4HB ແລະໂດເມນທີ່ຄ້າຍຄື Ig ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອຄົ້ນຫາບັນທຶກໂຄງສ້າງທີ່ຄ້າຍຄືກັນໃນຖານຂໍ້ມູນທາດໂປຼຕີນ 42 .ພວກເຮົາໄດ້ກໍານົດການຈັບຄູ່ທີ່ມີຄະແນນ Dali Z ສູງ, ການບິດເບືອນມາດຕະຖານຂະຫນາດນ້ອຍ, ແລະຄະແນນ LALI ຂະຫນາດໃຫຍ່ (ອັນສຸດທ້າຍແມ່ນຈໍານວນຂອງ residues ທຽບເທົ່າໂຄງສ້າງ).ໃນຂະນະທີ່ 10 hits ທໍາອິດຈາກການຄົ້ນຫາ ectodomain ເຕັມ (ຕາຕະລາງ S1) ມີ Z-score ຍອມຮັບຂອງ >842, ການຄົ້ນຫາສໍາລັບ 4HB ຫຼື Ig-like domain ດຽວສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າສ່ວນໃຫຍ່ຂອງ hits ເຫຼົ່ານີ້ກົງກັບ β-sandwiches ເທົ່ານັ້ນ.ພັບທົ່ວໆໄປພົບຢູ່ໃນທາດໂປຼຕີນຫຼາຍ.ທັງສາມການຄົ້ນຫາໃນ Dali ກັບຄືນມາພຽງແຕ່ຫນຶ່ງຜົນໄດ້ຮັບ: IZUMO1.
ມັນໄດ້ຖືກແນະນໍາມາດົນແລ້ວວ່າ SPACA6 ແລະ IZUMO1 ແບ່ງປັນຄວາມຄ້າຍຄືກັນຂອງໂຄງສ້າງ7,32,37.ເຖິງແມ່ນວ່າ ectodomains ຂອງທັງສອງ gamete fusion-associated proteins ແບ່ງປັນຕົວຕົນຂອງລໍາດັບພຽງແຕ່ 21% (ຮູບ S8a), ຫຼັກຖານທີ່ສະລັບສັບຊ້ອນ, ລວມທັງຮູບແບບພັນທະບັດ disulfide ທີ່ຖືກຮັກສາໄວ້ແລະໂດເມນ C-terminal Ig-like ຄາດຄະເນໃນ SPACA6, ໄດ້ອະນຸຍາດໃຫ້ຄວາມພະຍາຍາມໃນຕົ້ນໆໃນການສ້າງ. ຮູບແບບ homology ຂອງ A a SPACA6 mouse ໂດຍໃຊ້ IZUMO1 ເປັນ template37.ໂຄງສ້າງຂອງພວກເຮົາຢືນຢັນການຄາດຄະເນເຫຼົ່ານີ້ແລະສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງລະດັບທີ່ແທ້ຈິງຂອງຄວາມຄ້າຍຄືກັນ.ໃນຄວາມເປັນຈິງ, ໂຄງສ້າງ SPACA6 ແລະ IZUMO137,43,44 ແບ່ງປັນສະຖາປັດຕະຍະກໍາສອງໂດເມນດຽວກັນ (ຮູບ S8b) ກັບໂດເມນ 4HB ແລະ Ig-like β-sandwich ທີ່ຄ້າຍຄືກັນທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ໂດຍພາກພື້ນ hinge (ຮູບ S8c).
IZUMO1 ແລະ SPACA6 4HB ມີຄວາມແຕກຕ່າງກັນທົ່ວໄປຈາກມັດກ້ຽວວຽນທົ່ວໄປ.4HBs ປົກກະຕິ, ຄືກັບທີ່ພົບເຫັນຢູ່ໃນສະລັບສັບຊ້ອນທາດໂປຼຕີນຈາກ SNARE ທີ່ມີສ່ວນຮ່ວມໃນ endosomal fusion 45,46, ມີ helices ທີ່ມີຊ່ອງຫວ່າງເທົ່າທຽມກັນຮັກສາ curvature ຄົງທີ່ປະມານແກນກາງ 47. ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ໂດເມນ helical ໃນທັງສອງ IZUMO1 ແລະ SPACA6 ໄດ້ຖືກບິດເບືອນ, ມີຄວາມໂຄ້ງທີ່ປ່ຽນແປງໄດ້ແລະ. ການຫຸ້ມຫໍ່ທີ່ບໍ່ສະເຫມີກັນ (ຮູບ S8d).ການບິດ, ອາດຈະເກີດມາຈາກສາມຫຼ່ຽມທີ່ສ້າງຂຶ້ນໂດຍ helices 1′, 1 ແລະ 2, ຖືກເກັບຮັກສາໄວ້ໃນ IZUMO1 ແລະ SPACA6 ແລະສະຖຽນລະພາບໂດຍ motif CXXC ດຽວກັນໃນ helix 1′.ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ພັນທະບັດ disulfide ເພີ່ມເຕີມທີ່ພົບເຫັນຢູ່ໃນ SPACA6 (Cys41 ແລະ Cys55 covalently ເຊື່ອມຕໍ່ helices 1 ແລະ 2 ຂ້າງເທິງ) ສ້າງແຫຼມແຫຼມຢູ່ປາຍແຫຼມ, ເຮັດໃຫ້ SPACA6 ບິດຫຼາຍກ່ວາ IZUMO1, ມີສາມຫຼ່ຽມຢູ່ຕາມໂກນທີ່ຊັດເຈນກວ່າ.ນອກຈາກນັ້ນ, IZUMO1 ຂາດ Arg37 ສັງເກດເຫັນຢູ່ໃນໃຈກາງຂອງຢູ່ຕາມໂກນນີ້ໃນ SPACA6.ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, IZUMO1 ມີຫຼັກ hydrophobic ປົກກະຕິກວ່າຂອງສານຕົກຄ້າງ aliphatic ແລະກິ່ນຫອມ.
IZUMO1 ມີໂດເມນທີ່ຄ້າຍຄື Ig ປະກອບດ້ວຍ β-sheet43 ສອງຊັ້ນແລະຫ້າສາຍ.strand ພິເສດໃນ IZUMO1 ທົດແທນການ coil ໃນ SPACA6, ເຊິ່ງພົວພັນກັບສາຍ F ເພື່ອຈໍາກັດການຜູກມັດ hydrogen ກະດູກສັນຫຼັງໃນ strand.ຈຸດທີ່ຫນ້າສົນໃຈຂອງການປຽບທຽບແມ່ນຄ່າໃຊ້ຈ່າຍດ້ານຫນ້າຄາດຄະເນຂອງໂດເມນທີ່ຄ້າຍຄື Ig ຂອງສອງທາດໂປຼຕີນ.ພື້ນຜິວ IZUMO1 ແມ່ນມີຄ່າລົບຫຼາຍກ່ວາພື້ນຜິວ SPACA6.ຄ່າບໍລິການເພີ່ມເຕີມແມ່ນຕັ້ງຢູ່ໃກ້ກັບ C-terminus ທີ່ປະເຊີນກັບເຍື່ອອະສຸຈິ.ໃນ SPACA6, ພາກພື້ນດຽວກັນມີຄ່າທີ່ເປັນກາງ ຫຼື ບວກ (ຮູບ S8e).ຕົວຢ່າງ, ດ້ານ hydrophobic (ຂອບບາງກວ່າ) ແລະຂຸມທີ່ມີຄ່າບວກ (ຂອບກວ້າງ) ໃນ SPACA6 ແມ່ນຄິດຄ່າລົບໃນ IZUMO1.
ເຖິງແມ່ນວ່າການພົວພັນແລະອົງປະກອບໂຄງສ້າງຂັ້ນສອງລະຫວ່າງ IZUMO1 ແລະ SPACA6 ໄດ້ຖືກຮັກສາໄວ້ໄດ້ດີ, ການຈັດລໍາດັບໂຄງສ້າງຂອງໂດເມນທີ່ຄ້າຍຄືກັບ Ig ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າທັງສອງໂດເມນແຕກຕ່າງກັນໃນທິດທາງທົ່ວໄປຂອງພວກເຂົາທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບກັນແລະກັນ (ຮູບ S9).ມັດກ້ຽວວຽນຂອງ IZUMO1 ແມ່ນໂຄ້ງກ່ຽວກັບເບຕ້າແຊນວິດ, ສ້າງຮູບຮ່າງ “boomerang” ທີ່ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນໜ້ານີ້ຢູ່ທີ່ປະມານ 50° ຈາກແກນກາງ.ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, beam helical ໃນ SPACA6 ໄດ້ອຽງປະມານ 10° ໃນທິດທາງກົງກັນຂ້າມ.ຄວາມແຕກຕ່າງໃນການປະຖົມນິເທດເຫຼົ່ານີ້ມີແນວໂນ້ມເນື່ອງຈາກຄວາມແຕກຕ່າງໃນພາກພື້ນ hinge.ໃນລະດັບລໍາດັບຂັ້ນຕົ້ນ, IZUMO1 ແລະ SPACA6 ມີຄວາມຄ້າຍຄືກັນໃນລໍາດັບເລັກນ້ອຍຢູ່ຝາພັບ, ຍົກເວັ້ນສານຕົກຄ້າງຂອງ cysteine, glycine ແລະອາຊິດ aspartic.ດັ່ງນັ້ນ, ພັນທະບັດ hydrogen ແລະເຄືອຂ່າຍ electrostatic ແມ່ນແຕກຕ່າງກັນຫມົດ.ອົງປະກອບໂຄງສ້າງຂັ້ນສອງ β-sheet ຖືກແບ່ງປັນໂດຍ IZUMO1 ແລະ SPACA6, ເຖິງແມ່ນວ່າຕ່ອງໂສ້ໃນ IZUMO1 ແມ່ນຍາວຫຼາຍແລະ 310 helix (helix 5) ແມ່ນເປັນເອກະລັກຂອງ SPACA6.ຄວາມແຕກຕ່າງເຫຼົ່ານີ້ເຮັດໃຫ້ທິດທາງໂດເມນທີ່ແຕກຕ່າງກັນສໍາລັບສອງທາດໂປຼຕີນທີ່ຄ້າຍຄືກັນຖ້າບໍ່ດັ່ງນັ້ນ.
ການຄົ້ນຫາເຊີຟເວີ Dali ຂອງພວກເຮົາໄດ້ເປີດເຜີຍວ່າ SPACA6 ແລະ IZUMO1 ເປັນພຽງແຕ່ສອງໂຄງສ້າງທີ່ກໍານົດການທົດລອງທີ່ເກັບໄວ້ໃນຖານຂໍ້ມູນທາດໂປຼຕີນທີ່ມີ 4HB ເທົ່ານີ້ (ຕາຕະລາງ S1).ບໍ່ດົນມານີ້, DeepMind (Alphabet/Google) ໄດ້ພັດທະນາ AlphaFold, ລະບົບເຄືອຂ່າຍ neural ທີ່ສາມາດຄາດຄະເນໄດ້ຢ່າງຖືກຕ້ອງກ່ຽວກັບໂຄງສ້າງ 3D ຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກລໍາດັບຕົ້ນຕໍ48.ບໍ່ດົນຫລັງຈາກພວກເຮົາແກ້ໄຂໂຄງສ້າງ SPACA6, ຖານຂໍ້ມູນ AlphaFold ໄດ້ຖືກປ່ອຍອອກມາ, ໃຫ້ຮູບແບບໂຄງສ້າງທີ່ຄາດເດົາໄດ້ກວມເອົາ 98.5% ຂອງທາດໂປຼຕີນທັງຫມົດໃນ proteome48,49 ຂອງມະນຸດ.ການນໍາໃຊ້ໂຄງສ້າງ SPACA6 ຂອງພວກເຮົາທີ່ຖືກແກ້ໄຂເປັນຮູບແບບການຄົ້ນຫາ, ການຄົ້ນຫາແບບໂຄງສ້າງສໍາລັບຕົວແບບໃນ Proteome ຂອງມະນຸດ AlphaFold ໄດ້ກໍານົດຜູ້ສະຫມັກທີ່ມີຄວາມຄ້າຍຄືກັນໂຄງສ້າງທີ່ເປັນໄປໄດ້ກັບ SPACA6 ແລະ IZUMO1.ເນື່ອງຈາກຄວາມຖືກຕ້ອງອັນບໍ່ຫນ້າເຊື່ອຂອງ AlphaFold ໃນການຄາດເດົາ SPACA6 (ຮູບ S10a)—ໂດຍສະເພາະ 1.1 Å rms ectodomain ປຽບທຽບກັບໂຄງສ້າງທີ່ແກ້ໄຂແລ້ວຂອງພວກເຮົາ (ຮູບ S10b)—ພວກເຮົາໝັ້ນໃຈໄດ້ວ່າ SPACA6 ທີ່ກົງກັນນັ້ນມີແນວໂນ້ມທີ່ຈະຖືກຕ້ອງ.
ກ່ອນຫນ້ານີ້, PSI-BLAST ໄດ້ຄົ້ນຫາກຸ່ມ IZUMO1 ກັບສາມທາດໂປຼຕີນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບເຊື້ອອະສຸຈິ: IZUMO2, IZUMO3, ແລະ IZUMO450.AlphaFold ຄາດຄະເນວ່າທາດໂປຼຕີນຈາກຄອບຄົວ IZUMO ເຫຼົ່ານີ້ພັບເຂົ້າໄປໃນໂດເມນ 4HB ທີ່ມີຮູບແບບພັນທະບັດ disulfide ດຽວກັນກັບ IZUMO1 (ຮູບ 3a ແລະ S11), ເຖິງແມ່ນວ່າພວກເຂົາຂາດໂດເມນທີ່ຄ້າຍຄື Ig.ມັນໄດ້ຖືກສົມມຸດຕິຖານວ່າ IZUMO2 ແລະ IZUMO3 ແມ່ນໂປຣຕີນຂອງເຍື່ອຫຸ້ມຂ້າງຫນຶ່ງຄ້າຍຄືກັນກັບ IZUMO1, ໃນຂະນະທີ່ IZUMO4 ປະກົດວ່າເປັນຄວາມລັບ.ຫນ້າທີ່ຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ IZUMO 2, 3, ແລະ 4 ໃນ gamete fusion ບໍ່ໄດ້ຖືກກໍານົດ.IZUMO3 ເປັນທີ່ຮູ້ກັນວ່າມີບົດບາດໃນ biogenesis acrosome ໃນໄລຍະການພັດທະນາຂອງເຊື້ອອະສຸຈິ51 ແລະທາດໂປຼຕີນຈາກ IZUMO ໄດ້ຖືກພົບເຫັນວ່າເປັນ complex50.ການອະນຸລັກທາດໂປຼຕີນຈາກ IZUMO ໃນສັດລ້ຽງລູກດ້ວຍນົມ, ສັດເລືອຄານ, ແລະ amphibians ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າການເຮັດວຽກທີ່ມີທ່າແຮງຂອງພວກມັນແມ່ນສອດຄ່ອງກັບທາດໂປຼຕີນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ gamete-fusion-fusion ທີ່ຮູ້ຈັກອື່ນໆເຊັ່ນ DCST1/2, SOF1, ແລະ FIMP.
ແຜນວາດຂອງສະຖາປັດຕະຍະກໍາໂດເມນຂອງ IST superfamily, ມີ 4HB, hinge, ແລະໂດເມນທີ່ຄ້າຍຄື Ig ເນັ້ນເປັນສີສົ້ມ, ສີຂຽວ, ແລະສີຟ້າ, ຕາມລໍາດັບ.IZUMO4 ມີພາກພື້ນ C-terminal ເປັນເອກະລັກທີ່ມີລັກສະນະສີດໍາ.ພັນທະບັດ disulfide ຢືນຢັນແລະ putative ແມ່ນສະແດງໃຫ້ເຫັນໂດຍເສັ້ນແຂງແລະຈຸດ, ຕາມລໍາດັບ.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYLTM8-F9Al), ແລະ DB: AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q3KNT9-F1) ຈະຖືກສະແດງຢູ່ໃນຊ່ວງສີດຽວກັນກັບແຜງ A. ພັນທະບັດ Disulfide ແມ່ນສະແດງເປັນສີສີມ່ວງ.helices transmembrane TMEM95, IZUMO2 ແລະ IZUMO3 ບໍ່ໄດ້ສະແດງ.
ບໍ່ເຫມືອນກັບທາດໂປຼຕີນຈາກ IZUMO, ທາດໂປຼຕີນຈາກ SPACA ອື່ນໆ (ເຊັ່ນ: SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5, ແລະ SPACA9) ແມ່ນຄິດວ່າມີໂຄງສ້າງທີ່ແຕກຕ່າງຈາກ SPACA6 (ຮູບ S12).ພຽງແຕ່ SPACA9 ມີ 4HB, ແຕ່ມັນບໍ່ຄາດວ່າຈະມີທິດທາງຕ້ານການຂະຫນານດຽວກັນຫຼືພັນທະບັດ disulfide ດຽວກັນກັບ SPACA6.ພຽງແຕ່ SPACA1 ມີໂດເມນທີ່ຄ້າຍຄື Ig ຄ້າຍຄືກັນ.AlphaFold ຄາດຄະເນວ່າ SPACA3, SPACA4 ແລະ SPACA5 ມີໂຄງສ້າງທີ່ແຕກຕ່າງກັນຫມົດກ່ວາ SPACA6.ຫນ້າສົນໃຈ, SPACA4 ຍັງເປັນທີ່ຮູ້ຈັກທີ່ຈະມີບົດບາດໃນການຈະເລີນພັນ, ແຕ່ໃນຂອບເຂດທີ່ໃຫຍ່ກວ່າ SPACA6, ແທນທີ່ຈະສ້າງຄວາມສະດວກໃນການໂຕ້ຕອບລະຫວ່າງເຊື້ອອະສຸຈິແລະ oocyte zona pellucida52.
ການຄົ້ນຫາ AlphaFold ຂອງພວກເຮົາພົບການຈັບຄູ່ອື່ນສໍາລັບ IZUMO1 ແລະ SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, ໂປຣຕີນ transmembrane ສະເພາະຂອງເຊື້ອອະສຸຈິອັນດຽວ, renders ຫນູຜູ້ຊາຍເປັນຫມັນເມື່ອ ablated 32,33.Spermatozoa ຂາດ TMEM95 ມີ morphology ປົກກະຕິ, ການເຄື່ອນໄຫວ, ແລະຄວາມສາມາດທີ່ຈະເຈາະ zona pellucida ແລະຜູກມັດກັບເຍື່ອໄຂ່, ແຕ່ບໍ່ສາມາດ fuse ກັບເຍື່ອ oocyte ໄດ້.ການສຶກສາທີ່ຜ່ານມາໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ TMEM95 ແບ່ງປັນຄວາມຄ້າຍຄືກັນຂອງໂຄງສ້າງກັບ IZUMO133.ແທ້ຈິງແລ້ວ, ຮູບແບບ AlphaFold ຢືນຢັນວ່າ TMEM95 ເປັນ 4HB ທີ່ມີຄູ່ດຽວກັນຂອງ motifs CXXC ເປັນ IZUMO1 ແລະ SPACA6 ແລະພັນທະບັດ disulfide ເພີ່ມເຕີມດຽວກັນລະຫວ່າງ helices 1 ແລະ 2 ທີ່ພົບເຫັນຢູ່ໃນ SPACA6 (ຮູບ 3a ແລະ S11).ເຖິງແມ່ນວ່າ TMEM95 ຂາດໂດເມນທີ່ຄ້າຍຄື Ig, ມັນມີພາກພື້ນທີ່ມີຮູບແບບພັນທະບັດ disulfide ຄ້າຍຄືກັນກັບພາກພື້ນ hinge SPACA6 ແລະ IZUMO1 (ຮູບ 3b).ໃນເວລາທີ່ພິມຫນັງສືໃບລານນີ້, ເຄື່ອງແມ່ຂ່າຍ preprint ໄດ້ລາຍງານໂຄງສ້າງຂອງ TMEM95, ຢືນຢັນຜົນໄດ້ຮັບ AlphaFold53.TMEM95 ແມ່ນຄ້າຍຄືກັນຫຼາຍກັບ SPACA6 ແລະ IZUMO1 ແລະຖືກວິວັດທະນາການອະນຸລັກແລ້ວຢູ່ໃນ amphibians (ຮູບ 4 ແລະ S13).
ການຄົ້ນຫາ PSI-BLAST ໃຊ້ຖານຂໍ້ມູນ NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP, ແລະ SOF1 ເພື່ອກໍານົດຕໍາແຫນ່ງຂອງລໍາດັບເຫຼົ່ານີ້ຢູ່ໃນຕົ້ນໄມ້ຂອງຊີວິດ.ໄລຍະຫ່າງລະຫວ່າງຈຸດສາຂາບໍ່ໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງຂະຫນາດ.
ຄວາມຄ້າຍຄືກັນຂອງໂຄງສ້າງໂດຍລວມທີ່ໂດດເດັ່ນລະຫວ່າງ SPACA6 ແລະ IZUMO1 ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າພວກເຂົາເຈົ້າກໍາລັງກໍ່ຕັ້ງສະມາຊິກຂອງ superfamily ໂຄງສ້າງທີ່ຖືກອະນຸລັກເຊິ່ງປະກອບມີທາດໂປຼຕີນ TMEM95 ແລະ IZUMO 2, 3, ແລະ 4.ສະມາຊິກທີ່ຮູ້ຈັກ: IZUMO1, SPACA6 ແລະ TMEM95.ເນື່ອງຈາກວ່າສະມາຊິກພຽງແຕ່ສອງສາມຄົນມີໂດເມນຄ້າຍຄື Ig, ຈຸດເດັ່ນຂອງ IST superfamily ແມ່ນໂດເມນ 4HB, ເຊິ່ງມີລັກສະນະພິເສດທີ່ພົບເລື້ອຍຂອງທາດໂປຼຕີນທັງຫມົດເຫຼົ່ານີ້: 1) Coiled 4HB ກັບ helices ຈັດລຽງເປັນຕົວຕ້ານການຂະຫນານ / ຂະຫນານ alternation (ຮູບ. 5a), 2) ມັດມີຮູບສາມລ່ຽມທີ່ປະກອບດ້ວຍສອງ helices ພາຍໃນມັດແລະ helix ຕັ້ງທີສາມ (ຮູບ. ພື້ນທີ່ທີ່ສໍາຄັນ (ຮູບ 5c). motif CXXC, ພົບຢູ່ໃນທາດໂປຼຕີນທີ່ຄ້າຍຄື thioredoxin, ເປັນທີ່ຮູ້ຈັກທີ່ຈະເຮັດວຽກ. ເປັນເຊັນເຊີ redox 54,55,56, ໃນຂະນະທີ່ motif ໃນສະມາຊິກຄອບຄົວ IST ສາມາດພົວພັນກັບ isomerases ທາດໂປຼຕີນຈາກ disulfide ເຊັ່ນ ERp57 ໃນ gamete fusion. ບົດບາດແມ່ນກ່ຽວຂ້ອງ 57,58.
ສະມາຊິກຂອງ IST superfamily ຖືກກໍານົດໂດຍສາມລັກສະນະລັກສະນະຂອງໂດເມນ 4HB: ສີ່ helices ສະລັບກັນລະຫວ່າງທິດທາງຂະຫນານແລະ antiparallel, ba-triangular bundle ໃບຫນ້າ helical, ແລະ motif ສອງ ca CXXC ສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນລະຫວ່າງໂມເລກຸນຂະຫນາດນ້ອຍ.) N-terminal helixes (ສີສົ້ມ) ແລະ hinge region β-hairpin (ສີຂຽວ).
ເນື່ອງຈາກຄວາມຄ້າຍຄືກັນລະຫວ່າງ SPACA6 ແລະ IZUMO1, ຄວາມສາມາດຂອງອະດີດໃນການຜູກມັດກັບ IZUMO1 ຫຼື JUNO ໄດ້ຖືກທົດສອບ.Biolayer interferometry (BLI) ແມ່ນວິທີການຜູກມັດທີ່ອີງໃສ່ kinetic ເຊິ່ງໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ໃນເມື່ອກ່ອນເພື່ອປະເມີນການໂຕ້ຕອບລະຫວ່າງ IZUMO1 ແລະ JUNO.ຫຼັງຈາກ incubation ຂອງເຊັນເຊີ biotin-labeled ກັບ IZUMO1 ເປັນ bait ທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສູງຂອງ JUNO analyte, ສັນຍານທີ່ເຂັ້ມແຂງໄດ້ຖືກກວດພົບ (ຮູບ S14a), ສະແດງໃຫ້ເຫັນການປ່ຽນແປງການຜູກມັດ induced ໃນຄວາມຫນາຂອງ biomaterial ທີ່ຕິດກັບປາຍເຊັນເຊີ.ສັນຍານທີ່ຄ້າຍຄືກັນ (ie, JUNO ບວກໃສ່ກັບເຊັນເຊີເປັນ bait ຕ້ານ IZUMO1 analyte) (ຮູບ S14b).ບໍ່ມີສັນຍານຖືກກວດພົບເມື່ອ SPACA6 ຖືກໃຊ້ເປັນການວິເຄາະຕໍ່ກັບເຊັນເຊີທີ່ຜູກມັດ IZUMO1 ຫຼືເຊັນເຊີ JUNO (ຮູບ S14a,b).ການຂາດສັນຍານນີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າໂດເມນ extracellular ຂອງ SPACA6 ບໍ່ພົວພັນກັບໂດເມນ extracellular ຂອງ IZUMO1 ຫຼື JUNO.
ເນື່ອງຈາກວ່າການວິເຄາະ BLI ແມ່ນອີງໃສ່ biotinylation ຂອງສານຕົກຄ້າງ lysine ຟຣີໃນທາດໂປຼຕີນຈາກ bait, ການແກ້ໄຂນີ້ສາມາດປ້ອງກັນການຜູກມັດຖ້າ residue lysine ມີສ່ວນຮ່ວມໃນການໂຕ້ຕອບ.ນອກຈາກນັ້ນ, ການວາງທິດທາງຂອງການຜູກມັດກັບເຊັນເຊີສາມາດສ້າງອຸປະສັກ steric, ດັ່ງນັ້ນການວິເຄາະແບບດັ້ງເດີມໄດ້ຖືກປະຕິບັດຢູ່ໃນ ectodomains SPACA6, IZUMO1 ແລະ JUNO ທີ່ປະສົມປະສານ.ເຖິງວ່າຈະມີສິ່ງນີ້, SPACA6 ບໍ່ໄດ້ລ່ວງລະເມີດກັບ IZUMO1 ຫຼື JUNO ທີ່ມີປ້າຍຊື່ຂອງລາວ (ຮູບ S14c,d), ໂດຍສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າບໍ່ມີປະຕິສໍາພັນທີ່ສອດຄ່ອງກັບສິ່ງທີ່ສັງເກດເຫັນໃນການທົດລອງ BLI.ໃນຖານະເປັນການຄວບຄຸມໃນທາງບວກ, ພວກເຮົາໄດ້ຢືນຢັນປະຕິສໍາພັນຂອງ JUNO ທີ່ມີປ້າຍຊື່ IZUMO1 ຂອງພຣະອົງ (ຮູບ S14e ແລະ S15).
ເຖິງວ່າຈະມີຄວາມຄ້າຍຄືກັນທາງດ້ານໂຄງສ້າງລະຫວ່າງ SPACA6 ແລະ IZUMO1, ຄວາມບໍ່ສາມາດຂອງ SPACA6 ທີ່ຈະຜູກມັດ JUNO ແມ່ນບໍ່ແປກໃຈ.ພື້ນຜິວຂອງ IZUMO1 ຂອງມະນຸດມີຫຼາຍກ່ວາ 20 residue ທີ່ພົວພັນກັບ JUNO, ລວມທັງ residue ຈາກແຕ່ລະພາກພື້ນຂອງສາມ (ເຖິງແມ່ນວ່າສ່ວນຫຼາຍແມ່ນຕັ້ງຢູ່ໃນເຂດ hinge) (ຮູບ S14f).ໃນບັນດາສິ່ງຕົກຄ້າງເຫຼົ່ານີ້, ມີພຽງອັນດຽວເທົ່ານັ້ນທີ່ຖືກອະນຸລັກຢູ່ໃນ SPACA6 (Glu70).ໃນຂະນະທີ່ການທົດແທນທີ່ຕົກຄ້າງຈໍານວນຫຼາຍຍັງຄົງຮັກສາຄຸນສົມບັດທາງຊີວະເຄມີຕົ້ນສະບັບຂອງມັນ, ຂີ້ເຫຍື້ອ Arg160 ທີ່ສໍາຄັນໃນ IZUMO1 ໄດ້ຖືກທົດແທນໂດຍ Asp148 ທີ່ຖືກຄິດຄ່າທໍານຽມທາງລົບໃນ SPACA6;ການສຶກສາທີ່ຜ່ານມາໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການກາຍພັນຂອງ Arg160Glu ໃນ IZUMO1 ເກືອບຈະຍົກເລີກການຜູກມັດກັບ JUNO43.ນອກຈາກນັ້ນ, ຄວາມແຕກຕ່າງໃນທິດທາງໂດເມນລະຫວ່າງ IZUMO1 ແລະ SPACA6 ເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນພື້ນທີ່ຫນ້າດິນຂອງສະຖານທີ່ຜູກມັດ JUNO ຂອງພາກພື້ນທີ່ທຽບເທົ່າຢູ່ໃນ SPACA6 (ຮູບ S14g).
ເຖິງວ່າຈະມີຄວາມຕ້ອງການທີ່ຮູ້ຈັກສໍາລັບ SPACA6 ສໍາລັບ fusion gamete ແລະຄວາມຄ້າຍຄືກັນຂອງມັນກັບ IZUMO1, SPACA6 ເບິ່ງຄືວ່າບໍ່ມີຫນ້າທີ່ທຽບເທົ່າ JUNO binding.ດັ່ງນັ້ນ, ພວກເຮົາໄດ້ສະແຫວງຫາທີ່ຈະລວມຂໍ້ມູນໂຄງສ້າງຂອງພວກເຮົາກັບຫຼັກຖານຂອງຄວາມສໍາຄັນທີ່ສະຫນອງໃຫ້ໂດຍຊີວະວິທະຍາວິວັດທະນາການ.ການສອດຄ່ອງຕາມລໍາດັບຂອງ SPACA6 homologues ສະແດງໃຫ້ເຫັນການອະນຸລັກໂຄງສ້າງທົ່ວໄປນອກເຫນືອຈາກສັດລ້ຽງລູກດ້ວຍນົມ.ຕົວຢ່າງ, ສານຕົກຄ້າງຂອງ cysteine ​​​​ແມ່ນມີຢູ່ເຖິງແມ່ນວ່າຢູ່ໃນ amphibians ທີ່ຢູ່ຫ່າງໄກ (ຮູບ 6a).ການນໍາໃຊ້ເຊີບເວີ ConSurf, ຂໍ້ມູນການຮັກສາການຈັດລໍາດັບຫຼາຍລໍາດັບຂອງ 66 ລໍາດັບໄດ້ຖືກແຜນທີ່ກັບຫນ້າດິນ SPACA6.ປະເພດຂອງການວິເຄາະນີ້ສາມາດສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າສານຕົກຄ້າງໃດໄດ້ຖືກເກັບຮັກສາໄວ້ໃນລະຫວ່າງການວິວັດທະນາການຂອງທາດໂປຼຕີນແລະສາມາດຊີ້ບອກວ່າພື້ນທີ່ຫນ້າດິນໃດມີບົດບາດໃນຫນ້າທີ່.
ການຈັດລຽງຕາມລໍາດັບຂອງ SPACA6 ectodomains ຈາກ 12 ຊະນິດທີ່ແຕກຕ່າງກັນທີ່ກະກຽມໂດຍໃຊ້ CLUSTAL OMEGA.ອີງຕາມການວິເຄາະ ConSurf, ຕໍາແຫນ່ງທີ່ອະນຸລັກຫຼາຍທີ່ສຸດແມ່ນຫມາຍເປັນສີຟ້າ.cysteine ​​​​ residues ແມ່ນເນັ້ນໃສ່ສີແດງ.ຂອບເຂດໂດເມນແລະອົງປະກອບໂຄງສ້າງຮອງແມ່ນສະແດງຢູ່ເທິງສຸດຂອງການຈັດຕໍາແຫນ່ງ, ບ່ອນທີ່ລູກສອນຊີ້ບອກ β-strands ແລະຄື້ນຟອງຊີ້ໃຫ້ເຫັນ helices.ຕົວລະບຸການເຂົ້າເຖິງຂອງ NCBI ປະກອບມີ: ມະນຸດ (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), ລີງ capuchin (Cebus mimic, XP_017359366), ມ້າ (Equus 1202305), ມ້າ (Equus caball) ຫຼື Equus 23030 (Equus caball) _23 XP_032_034).), ແກະ (Ovis aries, XP_014955560), ຊ້າງ (Loxodonta africana, XP_010585293), ໝາ (Canis lupus familyis, XP_025277208), ຫນູ (Mus musculus, NP_001156381), Tasmanian devil (Sarcophii, XP_10031, 100000000031, 11000000000000011156381), Tasmanian devil (Sarcophii) s, 8) , 61_89 ແລະ Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).ຕົວເລກແມ່ນອີງໃສ່ຄໍາສັ່ງຂອງມະນຸດ.b ການເປັນຕົວແທນຂອງຫນ້າດິນຂອງໂຄງສ້າງ SPACA6 ກັບ 4HB ຢູ່ເທິງສຸດແລະໂດເມນຄ້າຍຄື Ig ຢູ່ດ້ານລຸ່ມ, ສີໂດຍອີງໃສ່ການຄາດຄະເນການອະນຸລັກຈາກເຄື່ອງແມ່ຂ່າຍ ConSurf.ສ່ວນທີ່ຖືກຮັກສາໄວ້ດີທີ່ສຸດແມ່ນສີຟ້າ, ສ່ວນທີ່ເກັບຮັກສາໄວ້ປານກາງແມ່ນສີຂາວ, ແລະເກັບຮັກສາໄວ້ໜ້ອຍທີ່ສຸດແມ່ນສີເຫຼືອງ.cysteine ​​ສີມ່ວງ.3 ແຜ່ນຕິດພື້ນຜິວສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງການປົກປ້ອງລະດັບສູງແມ່ນສະແດງຢູ່ໃນແຜ່ນຕິດປ້າຍ inset 1, 2 ແລະ 3. A ກາຕູນ 4HB ແມ່ນສະແດງຢູ່ໃນ inset ຢູ່ເທິງຂວາ (ຮູບແບບສີດຽວກັນ).
ໂຄງປະກອບການ SPACA6 ມີສາມເຂດພື້ນຜິວທີ່ມີການອະນຸລັກສູງ (ຮູບ 6b).Patch 1 ກວມເອົາ 4HB ແລະພາກພື້ນ hinge ແລະປະກອບດ້ວຍສອງຂົວ CXXC disulfide ອະນຸລັກ, ເຄືອຂ່າຍ hinge Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (ຮູບ S7), ແລະສາມສານຕົກຄ້າງທີ່ມີກິ່ນຫອມພາຍນອກທີ່ອະນຸລັກ (Phe31, Tyr73, Phe137).ຂອບທີ່ກວ້າງກວ່າຂອງໂດເມນທີ່ຄ້າຍຄື Ig (ຮູບ S6e), ເຊິ່ງເປັນຕົວແທນຂອງສານຕົກຄ້າງທີ່ມີຄ່າໃນທາງບວກຫຼາຍອັນຢູ່ເທິງໜ້າເຊື້ອອະສຸຈິ.ຫນ້າສົນໃຈ, patch ນີ້ປະກອບດ້ວຍ epitope ພູມຕ້ານທານທີ່ໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນກ່ອນຫນ້ານີ້ທີ່ຈະແຊກແຊງການເຮັດວຽກ SPACA6 30.ພາກພື້ນ 3 ຂະຫຍາຍ hinge ແລະຂ້າງຫນຶ່ງຂອງໂດເມນທີ່ຄ້າຍຄື Ig;ພາກພື້ນນີ້ປະກອບດ້ວຍ prolines ອະນຸລັກ (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) ແລະສານຕົກຄ້າງຂົ້ວໂລກ/ສາກໄຟ.ເປັນເລື່ອງແປກທີ່, ສ່ວນໃຫຍ່ຂອງການຕົກຄ້າງຢູ່ໃນຫນ້າດິນຂອງ 4HB ແມ່ນຕົວແປສູງ (ຮູບ 6b), ເຖິງແມ່ນວ່າ fold ໄດ້ຖືກອະນຸລັກຕະຫຼອດ SPACA6 homologue (ຕາມການລະບຸໄວ້ໂດຍການອະນຸລັກຂອງຫຼັກມັດ hydrophobic) ແລະນອກເຫນືອການ superfamily IST.
ເຖິງແມ່ນວ່ານີ້ແມ່ນເຂດທີ່ນ້ອຍທີ່ສຸດໃນ SPACA6 ທີ່ມີອົງປະກອບໂຄງສ້າງຂັ້ນສອງທີ່ສາມາດກວດພົບໄດ້ຫນ້ອຍທີ່ສຸດ, ພື້ນທີ່ທີ່ເຫຼືອຂອງ hinge ຈໍານວນຫຼາຍ (ລວມທັງພາກພື້ນ 3) ໄດ້ຖືກອະນຸລັກສູງໃນບັນດາ SPACA6 homologues, ເຊິ່ງອາດຈະຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າການວາງທິດທາງຂອງມັດ helical ແລະ β-sandwich ມີບົດບາດ.ເປັນແບບອະນຸລັກ.ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ເຖິງວ່າຈະມີການຜູກມັດ hydrogen ຢ່າງກວ້າງຂວາງແລະເຄືອຂ່າຍ electrostatic ໃນເຂດ hinge ຂອງ SPACA6 ແລະ IZUMO1, ຫຼັກຖານຂອງຄວາມຍືດຫຍຸ່ນພາຍໃນສາມາດເຫັນໄດ້ໃນການຈັດຕໍາແຫນ່ງຂອງໂຄງສ້າງທີ່ອະນຸຍາດຫຼາຍຂອງ IZUMO137,43,44.ການຈັດຮຽງຂອງແຕ່ລະໂດເມນທັບຊ້ອນກັນໄດ້ດີ, ແຕ່ການວາງທິດທາງຂອງໂດເມນທີ່ພົວພັນກັບກັນແລະກັນແຕກຕ່າງກັນຈາກ 50° ຫາ 70° ຈາກແກນກາງ (ຮູບ S16).ເພື່ອເຂົ້າໃຈນະໂຍບາຍດ້ານການສອດຄ່ອງຂອງ SPACA6 ໃນການແກ້ໄຂ, ການທົດລອງ SAXS ໄດ້ຖືກປະຕິບັດ (ຮູບ S17a,b).Ab initio reconstruction ຂອງ SPACA6 ectodomain ສອດຄ່ອງກັບໂຄງສ້າງໄປເຊຍກັນ rod (ຮູບ S18), ເຖິງແມ່ນວ່າດິນຕອນ Kratky ສະແດງໃຫ້ເຫັນລະດັບຄວາມຍືດຫຍຸ່ນບາງ (ຮູບ S17b).ຄວາມສອດຄ່ອງນີ້ກົງກັນຂ້າມກັບ IZUMO1, ໃນທີ່ທາດໂປຼຕີນທີ່ບໍ່ມີຜູກມັດສົມມຸດວ່າຮູບຮ່າງຂອງ boomerang ທັງຢູ່ໃນເສັ້ນດ່າງແລະໃນ solution43.
ເພື່ອກໍານົດເຂດທີ່ມີຄວາມຍືດຫຍຸ່ນໂດຍສະເພາະ, ການວັດແທກລະດັບມະຫາຊົນຂອງການແລກປ່ຽນ hydrogen-deuterium (H-DXMS) ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໃນ SPACA6 ແລະປຽບທຽບກັບຂໍ້ມູນທີ່ໄດ້ຮັບກ່ອນຫນ້ານີ້ໃນ IZUMO143 (ຮູບ 7a,b).SPACA6 ມີຄວາມຍືດຫຍຸ່ນຫຼາຍກ່ວາ IZUMO1 ຢ່າງຊັດເຈນ, ເປັນຫຼັກຖານສະແດງໂດຍການແລກປ່ຽນ deuterium ທີ່ສູງຂຶ້ນໃນທົ່ວໂຄງສ້າງຫຼັງຈາກການແລກປ່ຽນ 100,000 s.ໃນໂຄງສ້າງທັງສອງ, ພາກສ່ວນ C-terminal ຂອງພາກພື້ນ hinge ສະແດງໃຫ້ເຫັນລະດັບສູງຂອງການແລກປ່ຽນ, ເຊິ່ງອາດຈະອະນຸຍາດໃຫ້ຫມຸນຈໍາກັດຂອງ 4HB ແລະໂດເມນທີ່ຄ້າຍຄື Ig ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບກັນແລະກັນ.ຫນ້າສົນໃຈ, ພາກສ່ວນ C-terminal ຂອງ SPACA6 hinge, ປະກອບດ້ວຍ 147CDLPLDCP154 residue, ເປັນເຂດອະນຸລັກສູງ 3 (ຮູບ 6b), ອາດຈະຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າຄວາມຍືດຫຍຸ່ນຂອງ interdomain ເປັນລັກສະນະການອະນຸລັກຂອງ SPACA6 evolutionarily.ອີງຕາມການວິເຄາະຄວາມຍືດຫຍຸ່ນ, ຂໍ້ມູນການລະລາຍຄວາມຮ້ອນຂອງ CD ໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ SPACA6 (Tm = 51.2 ° C) ມີຄວາມຫມັ້ນຄົງຫນ້ອຍກວ່າ IZUMO1 (Tm = 62.9 ° C) (ຮູບ S1e ແລະ S19).
ຮູບພາບ H-DXMS ຂອງ SPACA6 ແລະ b IZUMO1.ອັດຕາແລກປ່ຽນ deuterium ໄດ້ຖືກກໍານົດຢູ່ໃນຈຸດເວລາທີ່ລະບຸໄວ້.ລະ​ດັບ​ການ​ແລກ​ປ່ຽນ hydrogen-deuterium ແມ່ນ​ຊີ້​ບອກ​ໂດຍ​ສີ​ໃນ​ຂະ​ຫນາດ gradient ຈາກ​ສີ​ຟ້າ (10​%​% ກັບ​ສີ​ແດງ (90​%​)​.ກ່ອງດໍາເປັນຕົວແທນຂອງພື້ນທີ່ຂອງການແລກປ່ຽນສູງ.ຂອບເຂດຂອງ 4HB, hinge ແລະ Ig-like domain ສັງເກດເຫັນໃນໂຄງສ້າງໄປເຊຍກັນແມ່ນສະແດງໃຫ້ເຫັນຂ້າງເທິງລໍາດັບຕົ້ນຕໍ.ລະດັບການແລກປ່ຽນ Deuterium ຢູ່ທີ່ 10 s, 1000 s, ແລະ 100,000 s ໄດ້ຖືກວາງແຜນໄວ້ໃນຕາຕະລາງເສັ້ນດ່າງ superimposed ເທິງຫນ້າໂມເລກຸນໂປ່ງໃສຂອງ SPACA6 ແລະ IZUMO1.ພາກສ່ວນຂອງໂຄງສ້າງທີ່ມີລະດັບການແລກປ່ຽນ deuterium ຕ່ໍາກວ່າ 50% ແມ່ນສີຂາວ.ພື້ນທີ່ສູງກວ່າ 50% ການແລກປ່ຽນ H-DXMS ແມ່ນເປັນສີໃນຂະໜາດ gradient.
ການໃຊ້ກົນລະຍຸດທາງພັນທຸກໍາຂອງ CRISPR/Cas9 ແລະຫນູໄດ້ນໍາໄປສູ່ການກໍານົດປັດໃຈຈໍານວນຫນຶ່ງທີ່ສໍາຄັນສໍາລັບການຜູກມັດຂອງເຊື້ອອະສຸຈິແລະໄຂ່.ນອກເຫນືອຈາກປະຕິສໍາພັນທີ່ມີລັກສະນະດີຂອງໂຄງສ້າງ IZUMO1-JUNO ແລະ CD9, ໂປຣຕີນສ່ວນໃຫຍ່ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ fusion gamete ຍັງຄົງເປັນໂຄງສ້າງແລະຫນ້າທີ່ enigmatic.ລັກສະນະທາງຊີວະພາບ ແລະໂຄງສ້າງຂອງ SPACA6 ແມ່ນອີກອັນໜຶ່ງຂອງການຕິດກັນ/ການປິດສະໜາໂມເລກຸນ ໃນລະຫວ່າງການໃສ່ປຸ໋ຍ.
SPACA6 ແລະສະມາຊິກອື່ນໆຂອງ superfamily IST ປະກົດວ່າໄດ້ຮັບການອະນຸລັກສູງໃນສັດລ້ຽງລູກດ້ວຍນົມເຊັ່ນດຽວກັນກັບນົກສ່ວນບຸກຄົນ, ສັດເລືອຄານ, ແລະ amphibians;ໃນຄວາມເປັນຈິງ, ມັນຄິດວ່າ SPACA6 ແມ່ນຕ້ອງການສໍາລັບການໃສ່ປຸ໋ຍໃນ zebrafish 59. ການແຜ່ກະຈາຍນີ້ແມ່ນຄ້າຍຄືກັນກັບທາດໂປຼຕີນຈາກ gamete fusion-associated ທີ່ຮູ້ຈັກອື່ນໆເຊັ່ນ DCST134, DCST234, FIMP31, ແລະ SOF132, ແນະນໍາວ່າປັດໃຈເຫຼົ່ານີ້ແມ່ນຂາດ HAP2 (ຍັງ. ເອີ້ນວ່າ GCS1) ໂປຣຕີນທີ່ຮັບຜິດຊອບສໍາລັບກິດຈະກໍາ catalytic ຂອງ protists ຈໍານວນຫຼາຍ., ພືດ , ແລະ arthropods .ທາດໂປຼຕີນຈາກ fusion fertilized 60, 61. ເຖິງວ່າຈະມີຄວາມຄ້າຍຄືກັນໂຄງສ້າງທີ່ເຂັ້ມແຂງລະຫວ່າງ SPACA6 ແລະ IZUMO1, ການຍົກເລີກການເຂົ້າລະຫັດພັນທຸກໍາຂອງທາດໂປຼຕີນເຫຼົ່ານີ້ເຮັດໃຫ້ການເປັນຫມັນໃນຫນູຊາຍ, ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າຫນ້າທີ່ຂອງພວກມັນໃນ gamete fusion ແມ່ນບໍ່ຊ້ໍາກັນ..ກວ້າງກວ່ານັ້ນ, ບໍ່ມີໂປຣຕີນຂອງເຊື້ອອະສຸຈິທີ່ຮູ້ຈັກທີ່ຕ້ອງການສໍາລັບໄລຍະການຍຶດຕິດຂອງ fusion ແມ່ນຊໍ້າຊ້ອນ.
ມັນຍັງຄົງເປັນຄໍາຖາມທີ່ເປີດເຜີຍວ່າ SPACA6 (ແລະສະມາຊິກອື່ນໆຂອງ IST superfamily) ເຂົ້າຮ່ວມໃນຈຸດເຊື່ອມຕໍ່ intergametic, ສ້າງເຄືອຂ່າຍ intragametic ເພື່ອທົດແທນທາດໂປຼຕີນທີ່ສໍາຄັນໄປສູ່ຈຸດ fusion, ຫຼືບາງທີອາດເຮັດຫນ້າທີ່ເປັນ fusogens elusive.ການສຶກສາຮ່ວມ immunoprecipitation ໃນຈຸລັງ HEK293T ໄດ້ເປີດເຜີຍການໂຕ້ຕອບລະຫວ່າງຄວາມຍາວເຕັມ IZUMO1 ແລະ SPACA632.ຢ່າງໃດກໍຕາມ, recombinant ectodomains ຂອງພວກເຮົາບໍ່ໄດ້ໂຕ້ຕອບໃນ vitro, ແນະນໍາວ່າການໂຕ້ຕອບທີ່ເຫັນໃນ Noda et al.ທັງສອງໄດ້ຖືກລຶບຖິ້ມໃນການກໍ່ສ້າງ (ສັງເກດຫາງ cytoplasmic ຂອງ IZUMO1, ເຊິ່ງໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າບໍ່ຈໍາເປັນສໍາລັບການໃສ່ປຸ໋ຍ62).ອີກທາງເລືອກ, IZUMO1 ແລະ/ຫຼື SPACA6 ອາດຈະຕ້ອງການສະພາບແວດລ້ອມຜູກມັດສະເພາະທີ່ພວກເຮົາບໍ່ໄດ້ແຜ່ພັນໃນ vitro, ເຊັ່ນ: ຄວາມສອດຄ່ອງທາງດ້ານສະລີລະວິທະຍາ ຫຼືສະລັບສັບຊ້ອນໂມເລກຸນທີ່ມີໂປຣຕີນອື່ນໆ (ຮູ້ຈັກ ຫຼືຍັງບໍ່ທັນຄົ້ນພົບ).ເຖິງແມ່ນວ່າ ectodomain IZUMO1 ໄດ້ຖືກເຊື່ອວ່າເປັນການໄກ່ເກ່ຍການຕິດຕົວຂອງເຊື້ອອະສຸຈິກັບໄຂ່ໃນຊ່ອງ perivitelline, ຈຸດປະສົງຂອງ SPACA6 ectodomain ແມ່ນບໍ່ຈະແຈ້ງ.
ໂຄງສ້າງຂອງ SPACA6 ເປີດເຜີຍໃຫ້ເຫັນພື້ນຜິວທີ່ອະນຸລັກຫຼາຍອັນທີ່ອາດຈະມີສ່ວນຮ່ວມໃນການໂຕ້ຕອບຂອງທາດໂປຼຕີນ.ພາກສ່ວນທີ່ສະຫງວນໄວ້ຂອງພື້ນທີ່ hinge ທັນທີທີ່ຕິດກັບ motif CXXC (ກໍານົດ Patch 1 ຂ້າງເທິງ) ມີສານຕົກຄ້າງທີ່ມີກິ່ນຫອມຫຼາຍທີ່ປະເຊີນຫນ້າກັບພາຍນອກທີ່ມັກຈະກ່ຽວຂ້ອງກັບປະຕິສໍາພັນ hydrophobic ແລະ π-stacking ລະຫວ່າງ biomolecules.ດ້ານກວ້າງຂອງໂດເມນທີ່ຄ້າຍຄື Ig (ພາກພື້ນ 2) ປະກອບເປັນຮ່ອງທີ່ຖືກຄິດຄ່າບວກກັບ Arg ທີ່ຖືກອະນຸລັກສູງແລະສານຕົກຄ້າງຂອງລາວ, ແລະພູມຕ້ານທານກັບພາກພື້ນນີ້ກ່ອນຫນ້ານີ້ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອສະກັດກັ້ນ gamete fusion 30 .ພູມຕ້ານທານຮັບຮູ້ epitope ເສັ້ນຊື່ 212RIRPAQLTHRGTFS225, ເຊິ່ງມີສາມໃນຫົກສານຕົກຄ້າງ arginine ແລະຮັກສາໄວ້ສູງ His220.ມັນບໍ່ຊັດເຈນວ່າຄວາມຜິດປົກກະຕິແມ່ນຍ້ອນການອຸດຕັນຂອງສານຕົກຄ້າງສະເພາະເຫຼົ່ານີ້ຫຼືພາກພື້ນທັງຫມົດ.ສະຖານທີ່ຂອງຊ່ອງຫວ່າງນີ້ຢູ່ໃກ້ກັບ C-terminus ຂອງβ-sandwich ຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງການໂຕ້ຕອບ cis ກັບທາດໂປຼຕີນຈາກເຊື້ອອະສຸຈິໃກ້ຄຽງ, ແຕ່ບໍ່ແມ່ນໂປຣຕີນ oocyte.ນອກຈາກນັ້ນ, ການຮັກສາຄວາມຍືດຫຍຸ່ນທີ່ມີຄວາມຍືດຫຍຸ່ນສູງຂອງ tangle (ສະຖານທີ່ 3) ພາຍໃນ hinge ອາດຈະເປັນສະຖານທີ່ຂອງປະຕິສໍາພັນຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກທາດໂປຼຕີນຫຼື, ຫຼາຍກວ່ານັ້ນ, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງການຮັກສາຄວາມຍືດຫຍຸ່ນລະຫວ່າງສອງໂດເມນ.ບົດບາດຍິງຊາຍແມ່ນມີຄວາມສໍາຄັນຕໍ່ບົດບາດທີ່ບໍ່ຮູ້ຈັກຂອງ SPACA6.fusion ຂອງ gametes.
SPACA6 ມີຄຸນສົມບັດຂອງໂປຣຕີນທີ່ຕິດກັນລະຫວ່າງຈຸລັງ, ລວມທັງ Ig-like β-sandwiches.ທາດໂປຼຕີນຈາກກາວຫຼາຍ (ຕົວຢ່າງ, cadherins, integrins, adhesins, ແລະ IZUMO1) ມີຫນຶ່ງຫຼືຫຼາຍໂດເມນ β-sandwich ທີ່ຂະຫຍາຍທາດໂປຼຕີນຈາກເຍື່ອເຊນໄປສູ່ເປົ້າຫມາຍສິ່ງແວດລ້ອມ63,64,65.ໂດເມນທີ່ຄ້າຍຄື Ig ຂອງ SPACA6 ຍັງມີ motif ທີ່ພົບເຫັນທົ່ວໄປໃນ β-sandwiches ຂອງ adhesion ແລະ cohesion: doublets ຂອງ strands ຂະຫນານຢູ່ໃນຕອນທ້າຍຂອງ β-sandwiches, ຮູ້ຈັກເປັນ clamps ກົນຈັກ66.ມັນເຊື່ອວ່າ motif ນີ້ເພີ່ມຄວາມຕ້ານທານກັບກໍາລັງ shear, ທີ່ມີຄຸນຄ່າສໍາລັບທາດໂປຼຕີນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບປະຕິສໍາພັນລະຫວ່າງຈຸລັງ.ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ເຖິງວ່າຈະມີຄວາມຄ້າຍຄືກັນນີ້ກັບ adhesins, ປະຈຸບັນບໍ່ມີຫຼັກຖານວ່າ SPACA6 ພົວພັນກັບໄຂ່ຂາວ.SPACA6 ectodomain ບໍ່ສາມາດຜູກມັດກັບ JUNO, ແລະຈຸລັງ SPACA6-expressing HEK293T, ດັ່ງທີ່ສະແດງຢູ່ນີ້, ບໍ່ຄ່ອຍພົວພັນກັບ oocytes ຂາດ zona 32 .ຖ້າ SPACA6 ສ້າງພັນທະບັດ intergametic, ປະຕິສໍາພັນເຫຼົ່ານີ້ອາດຈະຕ້ອງການການດັດແກ້ຫລັງການແປຫຼືຖືກສະຖຽນລະພາບໂດຍທາດໂປຼຕີນຈາກເຊື້ອອະສຸຈິອື່ນໆ.ໃນການສະຫນັບສະຫນູນສົມມຸດຕິຖານສຸດທ້າຍ, ເຊື້ອອະສຸຈິທີ່ຂາດແຄນ IZUMO1 ຜູກມັດກັບ oocytes, ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າໂມເລກຸນອື່ນທີ່ບໍ່ແມ່ນ IZUMO1 ແມ່ນມີສ່ວນຮ່ວມໃນຂັ້ນຕອນການຍຶດຕິດ gamete 27 .
ທາດໂປຼຕີນຈາກເຊື້ອໄວຣັດ, ຈຸລັງ, ແລະການພັດທະນາຫຼາຍມີຄຸນສົມບັດທີ່ຄາດຄະເນການເຮັດວຽກຂອງພວກມັນເປັນ fusogens.ຕົວຢ່າງ, glycoproteins fusion ໄວຣັສ (ຫ້ອງຮຽນ I, II ແລະ III) ມີ hydrophobic fusion peptide ຫຼື loop ໃນຕອນທ້າຍຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ເຂົ້າໄປໃນເຍື່ອເຈົ້າພາບ.ແຜນທີ່ hydrophilicity ຂອງ IZUMO143 ແລະໂຄງສ້າງ (ກໍານົດແລະຄາດຄະເນ) ຂອງ superfamily IST ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າບໍ່ມີ hydrophobic fusion peptide.ດັ່ງນັ້ນ, ຖ້າໂປຣຕີນໃດໆໃນຄອບຄົວ IST ເຮັດວຽກເປັນ fusogens, ພວກມັນເຮັດໃນລັກສະນະທີ່ແຕກຕ່າງຈາກຕົວຢ່າງທີ່ຮູ້ຈັກອື່ນໆ.
ສະຫຼຸບແລ້ວ, ຫນ້າທີ່ຂອງສະມາຊິກຂອງ superfamily IST ຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ fusion gamete ຍັງຄົງເປັນຄວາມລຶກລັບ tantalizing.ໂມເລກຸນ SPACA6 recombinant ທີ່ມີລັກສະນະຂອງພວກເຮົາ ແລະໂຄງສ້າງທີ່ແກ້ໄຂແລ້ວຂອງມັນຈະໃຫ້ຄວາມເຂົ້າໃຈກ່ຽວກັບຄວາມສໍາພັນລະຫວ່າງໂຄງສ້າງທີ່ແບ່ງປັນກັນເຫຼົ່ານີ້ ແລະບົດບາດຂອງພວກມັນໃນການຕິດພັນກັບ gamete ແລະ fusion.
ລຳດັບ DNA ທີ່ສອດຄ້ອງກັບ SPACA6 ectodomain ຂອງມະນຸດທີ່ຄາດການໄວ້ (ໝາຍເລກເຂົ້າໃຊ້ NCBI NP_001303901.1; residues 27–246) ແມ່ນ codon-optimized ສໍາລັບການສະແດງອອກໃນຈຸລັງ Drosophila melanogaster S2 ແລະຖືກສັງເຄາະເປັນຊິ້ນສ່ວນຂອງ gene ກັບ ລຳດັບ Kodons encoding (Genencoding)., ສັນຍານຄວາມລັບຂອງ BiP ແລະ 5′ ແລະ 3′ ທີ່ສອດຄ້ອງກັນສິ້ນສຸດລົງສໍາລັບການໂຄນນິນເອກະລາດ ligation ຂອງ gene ນີ້ເຂົ້າໄປໃນ vector ການສະແດງອອກ pMT ໂດຍອີງໃສ່ຕົວສົ່ງເສີມຂອງ metallothionein ດັດແກ້ສໍາລັບການເລືອກທີ່ມີ puromycin (pMT-puro).vector pMT-puro ເຂົ້າລະຫັດສະຖານທີ່ thrombin cleavage ຕິດຕາມດ້ວຍແທັກ C-terminal 10x-His (ຮູບ S2).
ການຖ່າຍທອດທີ່ຄົງທີ່ຂອງ vector SPACA6 pMT-puro ເຂົ້າໄປໃນເຊລ D. melanogaster S2 (Gibco) ໄດ້ຖືກປະຕິບັດຄ້າຍຄືກັນກັບໂປໂຕຄອນທີ່ໃຊ້ສໍາລັບ IZUMO1 ແລະ JUNO43.ເຊລ S2 ໄດ້ຖືກ thawed ແລະຂະຫຍາຍຕົວຢູ່ໃນຂະຫນາດກາງຂອງ Schneider (Gibco) ເສີມດ້ວຍຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນສຸດທ້າຍຂອງ 10% (v/v) ຄວາມຮ້ອນ-inactivated serum calf fetal (Gibco) ແລະ 1X antimycotic ຢາຕ້ານເຊື້ອ (Gibco).ຈຸລັງທາງຜ່ານຕົ້ນ (3.0 x 106 ເຊລ) ໄດ້ຖືກໃສ່ໃນນໍ້າສ້າງສ່ວນບຸກຄົນຂອງແຜ່ນ 6 ດີ (Corning).ຫຼັງຈາກ 24 ຊົ່ວໂມງຂອງການອົບຢູ່ທີ່ 27 ° C, ຈຸລັງໄດ້ຖືກຖ່າຍທອດດ້ວຍສ່ວນປະສົມຂອງ 2 mg ຂອງ SPACA6 pMT-puro vector ແລະ Effectene transfection reagent (Qiagen) ອີງຕາມໂປໂຕຄອນຂອງຜູ້ຜະລິດ.ຈຸລັງທີ່ຕິດເຊື້ອໄດ້ຖືກອົບເປັນເວລາ 72 ຊົ່ວໂມງ ແລະຈາກນັ້ນເກັບກ່ຽວດ້ວຍ 6 mg/ml puromycin.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ຈຸລັງໄດ້ຖືກແຍກອອກຈາກຂະຫນາດກາງຂອງ Schneider ທີ່ສົມບູນແລະຖືກຈັດໃສ່ໃນຂະຫນາດກາງຂອງ Insect-XPRESS (Lonza) ທີ່ບໍ່ເສຍຄ່າ serum ສໍາລັບການຜະລິດທາດໂປຼຕີນຈາກຂະຫນາດໃຫຍ່.A 1 L batch ຂອງ S2 cell culture ໄດ້ຖືກປູກເປັນ 8–10 × 106 ml-1 ຈຸລັງໃນ 2 L ທໍ່ລະບາຍອາກາດ polypropylene Erlenmeyer flask ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນຂ້າເຊື້ອດ້ວຍຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນສຸດທ້າຍຂອງ 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) ແລະ sterile ການກັ່ນຕອງ.induced.ວັດທະນະທໍາ induced ໄດ້ຖືກ incubated ຢູ່ທີ່ 27 ° C. ຢູ່ທີ່ 120 rpm ສໍາລັບສີ່ມື້.
ສື່ທີ່ມີເງື່ອນໄຂທີ່ບັນຈຸ SPACA6 ໄດ້ຖືກແຍກອອກໂດຍການສູນກາງສູນກາງທີ່ 5660 × g ຢູ່ທີ່ 4 ° C, ຕິດຕາມດ້ວຍລະບົບການກັ່ນຕອງການໄຫຼຂອງ tangential Centramate (Pall Corp) ທີ່ມີເຍື່ອ 10 kDa MWCO.ນຳໃຊ້ສື່ທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນທີ່ມີ SPACA6 ໃສ່ຖັນ 2 ml Ni-NTA agarose resin (Qiagen).ຢາງ Ni-NTA ໄດ້ຖືກລ້າງດ້ວຍ 10 ປະລິມານຖັນ (CV) ຂອງ buffer A ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນ 1 CV ຂອງ buffer A ໄດ້ຖືກເພີ່ມເພື່ອໃຫ້ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ imidazole ສຸດທ້າຍຂອງ 50 mM.SPACA6 ຖືກ eluted ດ້ວຍ 10 ml ຂອງ buffer A ເສີມດ້ວຍ imidazole ກັບຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສຸດທ້າຍຂອງ 500 mM.Restriction class thrombin (Millipore Sigma) ໄດ້ຖືກເພີ່ມໂດຍກົງໃສ່ທໍ່ dialysis (MWCO 12-14 kDa) ໃນ 1 ຫນ່ວຍຕໍ່ mg SPACA6 ທຽບກັບ 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 ແລະ 150 mM NaCl (buffer B) ສໍາລັບການ dialysis.) ຢູ່ທີ່ 4°C ເປັນເວລາ 48 ຊົ່ວໂມງ.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, SPACA6 ທີ່ຖືກລ້າງດ້ວຍ thrombin ໄດ້ຖືກເຈືອຈາງສາມເທົ່າເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງເກືອແລະຖືກໂຫລດໃສ່ຖັນການແລກປ່ຽນ cation 1 ml MonoS 5/50 GL (Cytiva/GE) ທີ່ສົມທຽບກັບ 10 mM Tris-HCl, pH 7.5.ການແລກປ່ຽນ cation ໄດ້ຖືກລ້າງດ້ວຍ 3 CV ຂອງ 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, ຫຼັງຈາກນັ້ນ SPACA6 ໄດ້ຖືກ eluted ກັບ gradient ເສັ້ນຂອງ 0 ຫາ 500 mM NaCl ໃນ 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 ສໍາລັບ 25 CV.ຫຼັງຈາກ ion chromatography ແລກປ່ຽນ ion, SPACA6 ມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນເປັນ 1 ml ແລະ eluted isocratically ຈາກຖັນ ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad) equilibated ກັບ buffer B. ອີງຕາມການ chromatogram, ສະນຸກເກີແລະສ່ວນສ່ວນເຂັ້ມຂຸ້ນປະກອບດ້ວຍ SPACA6.ຄວາມບໍລິສຸດໄດ້ຖືກຄວບຄຸມໂດຍ Coomassie-stained electrophoresis ໃນ 16% SDS-polyacrylamide gel.ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງທາດໂປຼຕີນໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍການດູດຊຶມຢູ່ທີ່ 280 nm ໂດຍໃຊ້ກົດຫມາຍ Beer-Lambert ແລະຄ່າສໍາປະສິດການສູນພັນ molar ທາງທິດສະດີ.
Purified SPACA6 ຖືກ dialyzed ຂ້າມຄືນຕໍ່ກັບ 10 mM sodium phosphate, pH 7.4 ແລະ 150 mM NaF ແລະ diluted ເປັນ 0.16 mg/mL ກ່ອນການວິເຄາະໂດຍ CD spectroscopy.ການສະແກນ Spectral ຂອງ CDs ທີ່ມີຄວາມຍາວຄື້ນຈາກ 185 ຫາ 260 nm ໄດ້ຖືກເກັບກໍາຢູ່ໃນ spectropolarimeter Jasco J-1500 ໂດຍໃຊ້ quartz cuvettes ທີ່ມີຄວາມຍາວທາງ optical 1 ມມ (Helma) ທີ່ 25 ° C ໃນອັດຕາ 50 nm / ນາທີ.CD spectra ຖືກແກ້ໄຂໂດຍພື້ນຖານ, ໂດຍສະເລ່ຍຫຼາຍກວ່າ 10 ການຊື້, ແລະປ່ຽນເປັນຮູບຮີທີ່ເຫຼືອຢູ່ (θMRE) ໃນອົງສາ cm2/dmol:
ບ່ອນທີ່ MW ແມ່ນນ້ໍາຫນັກໂມເລກຸນຂອງແຕ່ລະຕົວຢ່າງໃນ Da;N ແມ່ນຈໍານວນຂອງອາຊິດ amino;θ ແມ່ນຮູບສ້ວຍໃນ millidegrees;d ເທົ່າກັບຄວາມຍາວຂອງເສັ້ນທາງ optical ໃນ cm;ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງທາດໂປຼຕີນໃນຫນ່ວຍ.