347 12.7 * 1.24mm ທໍ່ສະແຕນເລດ coiled, ກົນໄກໂມເລກຸນຂອງ condensation electrostatic synchronous ແລະ coaggregation ຂອງ α-synuclein ແລະ tau

ຂໍ​ຂອບ​ໃຈ​ທ່ານ​ສໍາ​ລັບ​ການ​ຢ້ຽມ​ຢາມ Nature.com​.ທ່ານກໍາລັງໃຊ້ເວີຊັນຂອງຕົວທ່ອງເວັບທີ່ມີການສະຫນັບສະຫນູນ CSS ຈໍາກັດ.ເພື່ອປະສົບການທີ່ດີທີ່ສຸດ, ພວກເຮົາແນະນຳໃຫ້ທ່ານໃຊ້ບຣາວເຊີທີ່ອັບເດດແລ້ວ (ຫຼືປິດການນຳໃຊ້ໂໝດຄວາມເຂົ້າກັນໄດ້ໃນ Internet Explorer).ນອກຈາກນັ້ນ, ເພື່ອຮັບປະກັນການສະຫນັບສະຫນູນຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ, ພວກເຮົາສະແດງເວັບໄຊທ໌ທີ່ບໍ່ມີຮູບແບບແລະ JavaScript.
ຕົວເລື່ອນສະແດງສາມບົດຄວາມຕໍ່ສະໄລ້.ໃຊ້ປຸ່ມດ້ານຫຼັງ ແລະປຸ່ມຕໍ່ໄປເພື່ອເລື່ອນຜ່ານສະໄລ້, ຫຼືປຸ່ມຄວບຄຸມສະໄລ້ຢູ່ທ້າຍເພື່ອເລື່ອນຜ່ານແຕ່ລະສະໄລ້.

347 ຂໍ້ກໍາຫນົດທໍ່ສະແຕນເລດ

347 12.7*1.24mm ທໍ່ສະແຕນເລດ coiled

ເສັ້ນຜ່າສູນກາງພາຍນອກ: 6.00 mm OD ເຖິງ 914.4 mm OD, ຂະຫນາດເຖິງ 24” NB ທີ່ມີຢູ່ Ex-stock, OD Size Steel Tubes available Ex-stock

SS 347 ຄວາມຫນາຂອງທໍ່: 0.3mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, ແລະອື່ນໆ (0.5-12mm) ຫຼືຂະຫນາດທີ່ບໍ່ປົກກະຕິທີ່ຈະປັບແຕ່ງຕາມຄວາມຕ້ອງການ

ປະເພດ: SS 347 Seamless ທໍ່ |SS 347 ທໍ່ ERW |SS 347 ທໍ່ເຊື່ອມ |SS 347 ທໍ່ Fabricated |SS 347 ທໍ່ CDW, ທໍ່ LSAW / Seam-welded / Redrawn

ຮູບແບບ: SS 347 ທໍ່ກົມ/ທໍ່, SS 347 Square Pipes/Tubes, SS 347 Rectangular Pipes/Tubes, SS 347 Coiled Tubes, SS 347 “U” Shape, SS 347 Pan Cake Coils, SS 347 Hydraulic Tubes

ຄວາມຍາວ: ແບບສຸ່ມດຽວ, ສຸ່ມຄູ່ & ຄວາມຍາວທີ່ຕ້ອງການ: ປາຍທໍາມະດາ, ປາຍໂຄ້ງ, ປາຍລໍ້

ການປົກປ້ອງສິ້ນສຸດ: ຫມວກພາດສະຕິກ |ສໍາເລັດຮູບພາຍນອກ: 2B, No.4, No.1, No.8 ກະຈົກສໍາເລັດຮູບສໍາລັບທໍ່ສະແຕນເລດ, ສໍາເລັດຮູບຕາມຄວາມຕ້ອງການຂອງລູກຄ້າ

ເງື່ອນໄຂການຈັດສົ່ງ: Annealed ແລະ Pickled, polished, ສົດໃສ Annealed, ແຕ້ມເຢັນ

ການກວດສອບ, ບົດລາຍງານການທົດສອບ: Mill Test Certificate, EN 10204 3.1, Chemical Reports, Mechanical Reports, PMI Test Reports, Visual Inspection Reports, Third Party Inspection Reports, NABL Approved Lab Reports, Destructive Test Reports, Non Destructive Test Reports

ການຫຸ້ມຫໍ່: ບັນຈຸຢູ່ໃນກ່ອງໄມ້, ຖົງພາດສະຕິກ, ແຜ່ນເຫຼັກມັດ, ຫຼືຕາມຄວາມຕ້ອງການຂອງລູກຄ້າ.

ພິເສດ: ຂະຫນາດແລະຂໍ້ກໍາຫນົດອື່ນໆນອກເຫນືອຈາກຂ້າງເທິງສາມາດຜະລິດຕາມຄໍາຮ້ອງຂໍ

ຂະໜາດທໍ່ SS 347: 1/2 ນິ້ວ NB, OD ເຖິງ 24 ນິ້ວ

ASTM A312 347: ທໍ່ austenitic welded seamless ແລະ straight-seam ມີຈຸດປະສົງສໍາລັບອຸນຫະພູມສູງແລະການບໍລິການ corrosive ທົ່ວໄປ.ໂລຫະ Filler ບໍ່ໄດ້ຮັບອະນຸຍາດໃນລະຫວ່າງການເຊື່ອມ.

ASTM A358 347: ການເຊື່ອມໄຟຟ້າ fusion ທໍ່ austenitic ສໍາລັບ corrosive ແລະ / ຫຼືການບໍລິການອຸນຫະພູມສູງ.ໂດຍປົກກະຕິພຽງແຕ່ທໍ່ເຖິງ 8 ນິ້ວເທົ່ານັ້ນທີ່ຜະລິດຕາມຂໍ້ກໍາຫນົດນີ້.ການເພີ່ມໂລຫະ filler ແມ່ນອະນຸຍາດໃນລະຫວ່າງການເຊື່ອມ.

ASTM A790 347: ທໍ່ ferritic/austenitic (duplex) welded seamless ແລະ straight-seam ມີຈຸດປະສົງສໍາລັບການບໍລິການ corrosive ທົ່ວໄປ, ໂດຍສະເພາະແມ່ນເນັ້ນໃສ່ຄວາມຕ້ານທານກັບຄວາມກົດດັນ corrosion cracking.

ASTM A409 347: ທໍ່ໄຟຟ້າທີ່ມີເສັ້ນຜ່າສູນກາງ 14 "ຫາ 30" ເຊື່ອມໂລຫະທີ່ມີເສັ້ນຜ່າກາງຂະຫນາດໃຫຍ່ 14 "ຫາ 30" ດ້ວຍຝາ Sch5S ແລະ Sch 10S ສໍາລັບການກັດກ່ອນແລະ / ຫຼືສູງ.

ASTM A376 347: ທໍ່ austenitic seamless ສໍາລັບຄໍາຮ້ອງສະຫມັກອຸນຫະພູມສູງ.

ASTM A813 347: ທໍ່ austenitic ທໍ່ດຽວ, seam ດຽວ, ຫຼື double-welded austenitic ສໍາລັບອຸນຫະພູມສູງແລະການນໍາໃຊ້ corrosive ທົ່ວໄປ.

ASTM A814 347: ທໍ່ austenitic welded ເຢັນເຮັດວຽກສໍາລັບອຸນຫະພູມສູງແລະການບໍລິການ corrosive ທົ່ວໄປ.

ທໍ່ສະແຕນເລດ 347H ອົງປະກອບທາງເຄມີ

ທໍ່ສະແຕນເລດ 347H ຄຸນສົມບັດກົນຈັກ

ທໍ່ສະແຕນເລດ 347H ຄຸນສົມບັດທາງກາຍະພາບ

ເກຣດທຽບເທົ່າສໍາລັບທໍ່ສະແຕນເລດ 347H

ການລວບລວມ Amyloid alpha-synuclein (αS) ແມ່ນຈຸດເດັ່ນຂອງພະຍາດ Parkinson ແລະໂຣກ synucleinopathies ອື່ນໆ.ບໍ່ດົນມານີ້, ທາດໂປຼຕີນຈາກ tau ທົ່ວໄປທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບພະຍາດ Alzheimer ໄດ້ຖືກພົວພັນກັບ αS pathology ແລະພົບວ່າມີການລວມຕົວຢູ່ໃນທ້ອງຖິ່ນທີ່ອຸດົມສົມບູນ αS, ເຖິງແມ່ນວ່າກົນໄກໂມເລກຸນຂອງການລວມຕົວຂອງທາດໂປຼຕີນທັງສອງຍັງບໍ່ຈະແຈ້ງ.ພວກເຮົາລາຍງານຢູ່ທີ່ນີ້ວ່າໄລຍະ αS ແຍກອອກເປັນ condensates ຂອງແຫຼວໂດຍຜ່ານການ condensation ສະລັບສັບຊ້ອນ electrostatic ກັບ polypeptides ຄິດຄ່າທໍານຽມໃນທາງບວກເຊັ່ນ: tau.ອີງຕາມຄວາມໃກ້ຊິດຂອງ αS ສໍາລັບ polycations ແລະອັດຕາການລຸດລົງຂອງ valence ຂອງເຄືອຂ່າຍ coagulation, clots undergo gelation ຢ່າງໄວວາຫຼື coalescence ຕິດຕາມດ້ວຍການລວບລວມ amyloid ຊ້າ.ໂດຍການລວມເອົາຊຸດເຕັກນິກຊີວະພາບທີ່ກ້າວໜ້າ, ພວກເຮົາສາມາດກຳນົດລັກສະນະການແຍກໄລຍະ αS/Tau ທີ່ເປັນຂອງແຫຼວ ແລະ ກຳນົດປັດໃຈຫຼັກທີ່ນຳໄປສູ່ການສ້າງທາດປະສົມທີ່ຫຼາກຫຼາຍທີ່ມີທາດໂປຼຕີນຈາກທາດໂປຼຕີນຈາກທາດໂປຼຕິນຂອງແຫຼວ.
ນອກເໜືອໄປຈາກຊ່ອງເຍື່ອຫຸ້ມເຍື່ອແລ້ວ, ການແຍກເນື້ອເຍື່ອໃນຈຸລັງຍັງສາມາດເຮັດໄດ້ໂດຍການສ້າງຕັ້ງທາດໂປຼຕີນທີ່ອຸດົມສົມບູນ, ຄ້າຍຄືທາດແຫຼວທີ່ຫນາແຫນ້ນທີ່ເອີ້ນວ່າ condensates ຫຼື droplets ຊີວະພາບ, ໂດຍຜ່ານຂະບວນການທີ່ເອີ້ນວ່າການແຍກໄລຍະຂອງແຫຼວ (LLPS).ຢອດເຫຼົ່ານີ້ແມ່ນເກີດມາຈາກປະຕິສໍາພັນທາງໂລກທີ່ຫຼາກຫຼາຍ, ປົກກະຕິແລ້ວລະຫວ່າງທາດໂປຼຕີນຫຼືທາດໂປຼຕີນແລະ RNA, ແລະຮັບໃຊ້ຫນ້າທີ່ຫຼາກຫຼາຍໃນເກືອບທຸກລະບົບຊີວິດ.ຈໍານວນທາດໂປຼຕີນທີ່ມີຄວາມສາມາດ LLP ຈໍານວນຫຼວງຫຼາຍສະແດງລໍາດັບຂອງຄວາມສັບສົນຕ່ໍາທີ່ມີຄວາມຜິດປົກກະຕິສູງໃນທໍາມະຊາດແລະການສ້າງ condensates ຊີວະໂມເລກຸນ3,4,5.ການສຶກສາທົດລອງຈໍານວນຫລາຍໄດ້ເປີດເຜີຍລັກສະນະທີ່ມີຄວາມຍືດຫຍຸ່ນ, ມັກຈະບໍ່ເປັນລະບຽບ, ແລະຄວາມຫຼາກຫຼາຍຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ປະກອບເປັນ condensates ຄ້າຍຄືຂອງແຫຼວເຫຼົ່ານີ້, ເຖິງແມ່ນວ່າມີຫນ້ອຍທີ່ຮູ້ຈັກກ່ຽວກັບຕົວກໍານົດໂມເລກຸນສະເພາະທີ່ຄວບຄຸມການເຕີບໂຕແລະການເຕີບໃຫຍ່ຂອງ condensates ເຫຼົ່ານີ້ໃຫ້ມີລັກສະນະແຂງກວ່າ. ລັດ..
ຂໍ້ມູນໃຫມ່ສະຫນັບສະຫນູນການສົມມຸດຕິຖານວ່າ LLPS ທີ່ມີທາດໂປຼຕີນຈາກຄວາມຜິດປົກກະຕິແລະການຫັນປ່ຽນຂອງ droplets ເຂົ້າໄປໃນໂຄງສ້າງແຂງອາດຈະເປັນເສັ້ນທາງຈຸລັງທີ່ກ່ຽວຂ້ອງທີ່ນໍາໄປສູ່ການລວມຕົວຂອງສານພິດທີ່ບໍ່ລະລາຍທີ່ມັກຈະເປັນຈຸດເດັ່ນຂອງພະຍາດ degenerative.ທາດໂປຼຕີນທີ່ບໍ່ເປັນລະບຽບພາຍໃນ (IDPs) ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ LLPS, ມັກຈະຖືກຄິດຄ່າສູງແລະມີຄວາມຍືດຫຍຸ່ນ, ມີຄວາມສໍາພັນກັບ neurodegeneration ຍາວຜ່ານຂະບວນການລວບລວມ amyloid.ໂດຍສະເພາະ, biomolecular IDP condensates ເຊັ່ນ FUS7 ຫຼື TDP-438 ຫຼືທາດໂປຼຕີນທີ່ມີໂດເມນສະລັບສັບຊ້ອນຕ່ໍາຂະຫນາດໃຫຍ່ເຊັ່ນ hnRNPA19 ໄດ້ຖືກສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງອາຍຸເຂົ້າໄປໃນຮູບແບບ gel ຫຼືແມ້ກະທັ້ງແຂງໂດຍຜ່ານຂະບວນການທີ່ເອີ້ນວ່າ fluidization.ປະສົມ.ໄປສູ່ການຫັນປ່ຽນໄລຍະແຂງ (LSPT) ເປັນຫນ້າທີ່ຂອງເວລາຫຼືເພື່ອຕອບສະຫນອງຕໍ່ການປ່ຽນແປງຫລັງການແປບາງຢ່າງຫຼືການກາຍພັນທີ່ສໍາຄັນທາງ pathological1,7.
IDP ອື່ນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ LLPS ໃນ vivo ແມ່ນ Tau, ທາດໂປຼຕີນທີ່ບໍ່ເປັນລະບຽບທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ microtubule ທີ່ມີການລວບລວມ amyloid ກ່ຽວຂ້ອງກັບພະຍາດ Alzheimer 10 ແຕ່ບໍ່ດົນມານີ້ໄດ້ກ່ຽວຂ້ອງກັບພະຍາດ Parkinson (PD) ແລະ synaptic nuclear proteinopathies 11, 12, 13 ອື່ນໆທີ່ກ່ຽວຂ້ອງ.Tau ໄດ້ຖືກສະແດງໃຫ້ເຫັນ dissociate spontaneously ຈາກການແກ້ໄຂ / cytoplasm ເນື່ອງຈາກປະຕິສໍາພັນ electrostatic ທີ່ເອື້ອອໍານວຍ, ເຊິ່ງກໍ່ໃຫ້ເກີດການສ້າງຕັ້ງຂອງ droplets ອຸດົມດ້ວຍ tau ເປັນທີ່ຮູ້ຈັກເປັນ coacervates electrostatic.ມັນຍັງໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນວ່າປະເພດຂອງປະຕິສໍາພັນທີ່ບໍ່ສະເພາະນີ້ແມ່ນກໍາລັງຂັບເຄື່ອນທາງຫລັງຂອງ condensates biomolecular ຫຼາຍໃນທໍາມະຊາດ15.ໃນກໍລະນີຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ tau, ການລວມຕົວຂອງ electrostatic ສາມາດຖືກສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນໂດຍການລວມຕົວແບບງ່າຍດາຍ, ໃນພື້ນທີ່ທີ່ມີຄ່າກົງກັນຂ້າມຂອງທາດໂປຼຕີນເຮັດໃຫ້ເກີດຂະບວນການແຕກແຍກ, ຫຼືໂດຍການລວບລວມສະລັບສັບຊ້ອນໂດຍຜ່ານການພົວພັນກັບໂພລີເມີທີ່ມີຄ່າລົບເຊັ່ນ RNA.
ບໍ່ດົນມານີ້, α-synuclein (αS), amyloid IDP implicated ໃນ PD ແລະພະຍາດ neurodegenerative ອື່ນໆທີ່ເອີ້ນກັນວ່າ synucleinopathy17,18, ໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນໃນ cellular ແລະສັດ model19,20 ເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ condensates ທີ່ມີພຶດຕິກໍາຂອງນ້ໍາ.ການສຶກສາໃນ vitro ໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ αS ຜ່ານ LLPS ດ້ວຍການລວບລວມແບບງ່າຍດາຍໂດຍຜ່ານການໂຕ້ຕອບ hydrophobic ສ່ວນໃຫຍ່, ເຖິງແມ່ນວ່າຂະບວນການນີ້ຕ້ອງການຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງທາດໂປຼຕີນສູງພິເສດແລະເວລາ incubation ຍາວຕາມປົກກະຕິ 19,21.ບໍ່ວ່າຈະເປັນ condensates ທີ່ມີ αS ທີ່ສັງເກດເຫັນຢູ່ໃນ vivo ຖືກສ້າງຂຶ້ນໂດຍຂະບວນການນີ້ຫຼືຂະບວນການ LLPS ອື່ນໆຍັງຄົງເປັນບັນຫາທີ່ສໍາຄັນທີ່ບໍ່ໄດ້ຮັບການແກ້ໄຂ.ເຊັ່ນດຽວກັນ, ເຖິງແມ່ນວ່າການລວບລວມ amyloid αS ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນຢູ່ໃນ neurons ໃນ PD ແລະ synucleinopathies ອື່ນໆ, ກົນໄກທີ່ແນ່ນອນທີ່ αS ຜ່ານການລວບລວມ amyloid intracellular ຍັງບໍ່ຈະແຈ້ງ, ຍ້ອນວ່າການສະແດງອອກຂອງທາດໂປຼຕີນນີ້ຫຼາຍເກີນໄປຈະບໍ່ເຮັດໃຫ້ເກີດຂະບວນການນີ້ໂດຍຕົວມັນເອງ.ຄວາມເສຍຫາຍຂອງເຊນເພີ່ມເຕີມແມ່ນມັກຈະຕ້ອງການ, ແນະນໍາວ່າສະຖານທີ່ cellular ບາງຫຼື microenvironments ແມ່ນຈໍາເປັນສໍາລັບການ renucleation ຂອງ intracellular αS amyloid ປະກອບ.ສະພາບແວດລ້ອມ cellular ໂດຍສະເພາະແມ່ນມັກຈະມີການລວບລວມອາດຈະເປັນພາຍໃນຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ condensates 23 .
ຫນ້າສົນໃຈ, αS ແລະ tau ໄດ້ຖືກພົບເຫັນວ່າຮ່ວມກັນຢູ່ໃນການລວມຕົວຂອງພະຍາດທີ່ມີລັກສະນະຢູ່ໃນມະນຸດທີ່ມີພະຍາດ Parkinson ແລະ synucleinopathies ອື່ນໆ 24,25 ແລະການທົດລອງໄດ້ລາຍງານຄວາມສໍາພັນທາງ pathological synergistic ລະຫວ່າງສອງທາດໂປຼຕີນ 26,27 ແນະນໍາຄວາມສໍາພັນທີ່ມີທ່າແຮງລະຫວ່າງການລວບລວມ αS ແລະ. tau ໃນພະຍາດ neurodegenerative.​ການ​ເຈັບ​ປ່ວຍ.αS ແລະ tau ໄດ້ຖືກພົບເຫັນວ່າມີປະຕິສໍາພັນແລະສົ່ງເສີມການລວມຕົວຂອງກັນແລະກັນໃນ vitro ແລະໃນ vivo 28,29 ແລະການລວບລວມ heterogeneous ທີ່ປະກອບດ້ວຍທາດໂປຼຕີນສອງເຫຼົ່ານີ້ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນຢູ່ໃນສະຫມອງຂອງຄົນເຈັບທີ່ມີ synucleinopathies 30 .ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ຫນ້ອຍແມ່ນເປັນທີ່ຮູ້ຈັກກ່ຽວກັບພື້ນຖານໂມເລກຸນຂອງປະຕິສໍາພັນລະຫວ່າງ αS ແລະ tau ແລະກົນໄກຂອງການລວມຕົວຂອງມັນ.αS ໄດ້ຖືກລາຍງານວ່າມີປະຕິກິລິຍາກັບ tau ໂດຍຜ່ານການດຶງດູດໄຟຟ້າສະຖິດລະຫວ່າງພາກພື້ນ C-terminal ທີ່ມີຄ່າທາງລົບສູງຂອງ αS ແລະພາກພື້ນທີ່ອຸດົມສົມບູນໃນສ່ວນກາງຂອງ tau, ເຊິ່ງຍັງອຸດົມໄປດ້ວຍສານຕົກຄ້າງທີ່ມີຄ່າບວກ.
ໃນການສຶກສານີ້, ພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ αS ຢ່າງແທ້ຈິງສາມາດແຍກອອກເປັນ droplets ໂດຍຜ່ານການ condensation ສະລັບສັບຊ້ອນ electrostatic ໃນທີ່ປະທັບຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ tau, ກົງກັນຂ້າມກັບປະຕິສໍາພັນຂອງມັນກັບ polypeptides ຄິດຄ່າບວກອື່ນໆເຊັ່ນ poly-L-lysine (pLK), ແລະໃນຂະບວນການນີ້.αS ເຮັດຫນ້າທີ່ເປັນໂມເລກຸນ scaffold ສໍາລັບເຄືອຂ່າຍ droplet.ພວກເຮົາໄດ້ກໍານົດຄວາມແຕກຕ່າງທີ່ສັງເກດເຫັນໃນຂະບວນການຂອງການຈະເລີນເຕີບໂຕຂອງ electrostatic αS coacervates, ເຊິ່ງກ່ຽວຂ້ອງກັບຄວາມແຕກຕ່າງຂອງ valency ແລະຄວາມເຂັ້ມແຂງຂອງປະຕິສໍາພັນຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບເຄືອຂ່າຍ coacervate.ຫນ້າສົນໃຈ, ພວກເຮົາໄດ້ສັງເກດເຫັນການລວມຕົວຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ αS ແລະ tau amyloid ໃນ coacervates ຂອງແຫຼວທີ່ມີຊີວິດຢູ່ດົນນານແລະໄດ້ກໍານົດບາງປັດໃຈສໍາຄັນທີ່ນໍາໄປສູ່ການລວມກັນຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກທັງສອງນີ້ໃນ coacervates ດັ່ງກ່າວ.ໃນທີ່ນີ້ພວກເຮົາອະທິບາຍຢ່າງລະອຽດກ່ຽວກັບຂະບວນການນີ້, ເຊິ່ງເປັນກົນໄກໂມເລກຸນທີ່ເປັນໄປໄດ້ທີ່ຕິດພັນກັບ colocalization ຂອງສອງທາດໂປຼຕີນໃນການລວມເອົາພະຍາດສະເພາະ.
αS ມີຫາງ C-terminal anionic ສູງຢູ່ທີ່ pH ທີ່ເປັນກາງ (ຮູບ 1a), ແລະພວກເຮົາສົມມຸດວ່າມັນສາມາດຜ່ານ LLPS ໂດຍຜ່ານການ condensation ຂອງສະລັບສັບຊ້ອນ electrostatic ກັບໂມເລກຸນ polycationic disordered polypeptide.ພວກເຮົາໃຊ້ 100-residue poly-L-lysine (pLK) ເປັນໂມເລກຸນຕົວແບບເລີ່ມຕົ້ນເນື່ອງຈາກລັກສະນະໂພລີເມີທີ່ມີຄ່າໃນທາງບວກແລະຜິດປົກກະຕິຢູ່ທີ່ pH 32. ທໍາອິດ, ພວກເຮົາຢືນຢັນວ່າ pLK ພົວພັນກັບ Ct domain ຂອງ αS ຜ່ານ Solution NMR spectroscopy. (ຮູບທີ 1b) ໂດຍໃຊ້ αS ທີ່ມີປ້າຍກຳກັບ 13C/15N ໃນການມີອັດຕາສ່ວນຂອງ molar αS:pLK ເພີ່ມຂຶ້ນ.ປະຕິສໍາພັນຂອງ pLK ກັບ Ct-domain ຂອງαS manifests ຕົວຂອງມັນເອງໃນ perturbations ຂອງການປ່ຽນແປງທາງເຄມີແລະການຫຼຸດລົງຂອງຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນສູງສຸດໃນພາກພື້ນຂອງທາດໂປຼຕີນນີ້.ຫນ້າສົນໃຈ, ເມື່ອພວກເຮົາປະສົມ αS ກັບ pLK ໃນຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ αS ປະມານ.5–25 µM ໃນທີ່ປະທັບຂອງ polyethylene glycol (5–15% PEG-8) (ປົກກະຕິ LLPS buffer: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) ພວກເຮົາທັນທີທັນໃດໂດຍຜ່ານພາກສະຫນາມກ້ວາງຂອງການສ້າງທາດໂປຼຕີນ. .ຢອດເມັດໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນໂດຍໃຊ້ fluorescence (WF) ແລະກ້ອງຈຸລະທັດພາກສະຫນາມສົດໃສ (BF) (ຮູບ 1c).ຢອດ 1-5 µm ທີ່ບັນຈຸ αS ເຂັ້ມຂຸ້ນ (ເພີ່ມ 1 µM AlexaFluor488-labeled αS, AF488-αS), ຄຸນສົມບັດໄຟຟ້າສະຖິດຂອງພວກມັນສາມາດມາຈາກຄວາມຕ້ານທານກັບ 10% 1,6-hexanediol (1,6-HD) ແລະຄວາມອ່ອນໄຫວຂອງມັນຕໍ່ກັບ ການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ NaCl (ຮູບ 1c).ລັກສະນະຄ້າຍຄືຂອງນ້ໍາຂອງ coacervates ຂອງ αS/pLK electrostatic complex ແມ່ນສະແດງໃຫ້ເຫັນໂດຍຄວາມສາມາດໃນການ fuse ພາຍໃນ milliseconds (ຮູບ 1d).ການນໍາໃຊ້ turbidimetry, ພວກເຮົາ quantified ການສ້າງຕັ້ງຂອງ droplets ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂເຫຼົ່ານີ້, ຢືນຢັນລັກສະນະ electrostatic ຂອງການໂຕ້ຕອບຕົ້ນຕໍທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງມັນ (ຮູບ 1e), ແລະການປະເມີນຜົນກະທົບຂອງອັດຕາສ່ວນໂພລີເມີຕ່າງໆໃນຂະບວນການ LLPS (ຮູບ 1f).ເຖິງແມ່ນວ່າການສ້າງ droplet ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນໃນໄລຍະຄວາມກ້ວາງຂອງອັດຕາສ່ວນໂພລີເມີ, ຂະບວນການແມ່ນເອື້ອອໍານວຍຫຼາຍເມື່ອ pLK ເກີນ αS.LLPs ຍັງໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນໂດຍນໍາໃຊ້ຕົວແທນການໂຍກຍ້າຍທີ່ແຕກຕ່າງກັນທາງເຄມີ dextran-70 (70 kDa) ຫຼືນໍາໃຊ້ຮູບແບບຕົວຢ່າງທີ່ຫລາກຫລາຍ, ລວມທັງການຢອດແກ້ວ, ຂຸມ microplate ຂອງວັດສະດຸຕ່າງໆ, Eppendorf ຫຼື quartz capillaries.
ການສະແດງແບບແຜນຂອງພາກພື້ນໂປຣຕີນທີ່ແຕກຕ່າງກັນໃນຕົວແປ WT-αS ແລະ ΔCt-αS ທີ່ໃຊ້ໃນການສຶກສານີ້.ໂດເມນ amphipathic N-terminal, ພາກພື້ນ hydrophobic amyloid-forming (NAC), ແລະໂດເມນ C-terminal ຄິດຄ່າລົບແມ່ນສະແດງເປັນສີຟ້າ, ສີສົ້ມ, ແລະສີແດງ, ຕາມລໍາດັບ.ແຜນທີ່ການຄິດຄ່າ Net Charge Per Residual (NCPR) ຂອງ WT-αS ຖືກສະແດງ.b ການວິເຄາະ NMR ຂອງປະຕິສໍາພັນ αS/pLK ໃນກໍລະນີທີ່ບໍ່ມີກຸ່ມ macromolecular.ເມື່ອຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ pLK ເພີ່ມຂຶ້ນ (αS:pLK ອັດຕາສ່ວນ molar ຂອງ 1:0.5, 1:1.5, ແລະ 1:10 ສະແດງໃຫ້ເຫັນເປັນສີຂຽວອ່ອນ, ສີຂຽວ, ແລະສີຂຽວຊ້ໍາ, ຕາມລໍາດັບ).c Coacervate αS/pLK (ອັດຕາສ່ວນ molar 1:10) ທີ່ 25 µM (1 µM AF488-labeled αS ຫຼື Atto647N-labeled pLK for WF imaging) ໃນ LLPS buffer (ເທິງ) ຫຼື ເສີມດ້ວຍ 500 mM NaCl (ຊ້າຍລຸ່ມ) ຫຼື ຫຼັງ % 1,6-hexanediol (1,6-HD; ລຸ່ມຂວາ).ແຖບຂະຫນາດ = 20 µm.d ຮູບພາບກ້ອງຈຸລະທັດທີ່ເປັນຕົວແທນຂອງ BF droplet fusion ຂອງ αS/pLK (ອັດຕາສ່ວນ molar 1:10) ຢູ່ທີ່ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ 25 μM;ລູກສອນຊີ້ບອກການລວມຂອງແຕ່ລະຢອດ (ລູກສອນສີແດງ ແລະສີເຫຼືອງ) ເຂົ້າໄປໃນການຫຼຸດລົງໃຫມ່ (ລູກສອນສີສົ້ມ) ພາຍໃນ 200 ms).ແຖບຂະຫນາດ = 20 µm.e ການກະແຈກກະຈາຍແສງສະຫວ່າງ (ທີ່ 350 nm) αS/pLK ການລວບລວມໃນ LLPS buffer ກ່ອນແລະຫຼັງຈາກເພີ່ມ 500 mM NaCl ຫຼື 10% 1,6-HD ທີ່ 25 µM αS (N = 3 ຕົວຢ່າງ replicates, ຄ່າສະເລ່ຍແລະມາດຕະຖານ deviation ຍັງຊີ້ໃຫ້ເຫັນ).f ຮູບພາບ BF (ເທິງ) ແລະການວິເຄາະກະແຈກກະຈາຍແສງສະຫວ່າງ (ຢູ່ 350 nm, ດ້ານລຸ່ມ) ຂອງການລວບລວມ αS / pLK ທີ່ 25 μM αS ດ້ວຍການເພີ່ມຂຶ້ນ αS: pLK molar ອັດຕາສ່ວນ (N = 3 ຕົວຢ່າງ replicates, ຄ່າສະເລ່ຍແລະມາດຕະຖານ deviation ຍັງຊີ້ໃຫ້ເຫັນ).ແຖບຂະຫນາດ = 10 µm.ແຖບຂະໜາດໃນຮູບໜຶ່ງສະແດງເຖິງຂະໜາດຂອງຮູບທັງໝົດໃນແຜງດຽວ.ຂໍ້ມູນດິບແມ່ນສະໜອງໃຫ້ໃນຮູບແບບຂອງໄຟລ໌ຂໍ້ມູນດິບ.
ອີງໃສ່ການສັງເກດການຂອງພວກເຮົາຂອງ αS/pLK electrostatic condensation ແລະການສັງເກດກ່ອນຫນ້າຂອງ αS ເປັນໂມເລກຸນລູກຄ້າຂອງ condensate tau / RNA ໂດຍຜ່ານການໂຕ້ຕອບໂດຍກົງກັບ tau31, ພວກເຮົາສົມມຸດວ່າ αS ແລະ tau ສາມາດແຍກຕົວຮ່ວມກັນກັບສານລະລາຍໃນກໍລະນີທີ່ບໍ່ມີ RNA. ຂົ້ນ.ໂດຍຜ່ານສະລັບສັບຊ້ອນໄຟຟ້າສະຖິດ, ແລະ αS ແມ່ນທາດໂປຼຕີນຈາກ scaffold ໃນ αS/Tau coacervates (ເບິ່ງການແຜ່ກະຈາຍຂອງຄ່າໃຊ້ຈ່າຍ tau ໃນຮູບ 2e).ພວກເຮົາສັງເກດເຫັນວ່າເມື່ອ 10 μM αS ແລະ 10 μM Tau441 (ປະກອບດ້ວຍ 1 μM AF488-αS ແລະ 1 μM Atto647N-Tau, ຕາມລໍາດັບ) ໄດ້ຖືກປະສົມເຂົ້າກັນໃນ LLPS buffer, ພວກມັນສ້າງຕົວລວບລວມທາດໂປຼຕີນທີ່ປະກອບດ້ວຍທາດໂປຼຕີນຈາກທັງສອງ, ດັ່ງທີ່ເຫັນໂດຍກ້ອງຈຸລະທັດ WF.(ຮູບ 2a).colocalization ຂອງສອງທາດໂປຼຕີນໃນ droplets ໄດ້ຖືກຢືນຢັນໂດຍ confocal (CF) microscopy (ຕື່ມ Fig. 1a).ພຶດຕິກໍາທີ່ຄ້າຍຄືກັນໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນເມື່ອ dextran-70 ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນຕົວແທນການລວບລວມ (ຕື່ມ Fig. 1c).ການນໍາໃຊ້ທັງ PEG ທີ່ມີປ້າຍຊື່ FITC ຫຼື dextran, ພວກເຮົາພົບເຫັນວ່າທັງສອງຕົວແທນທີ່ແອອັດໄດ້ຖືກແຈກຢາຍຢ່າງເທົ່າທຽມກັນໃນທົ່ວຕົວຢ່າງ, ບໍ່ສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງການແບ່ງແຍກຫຼືສະມາຄົມ (ຮູບພາບເສີມ 1d).ແທນທີ່ຈະ, ມັນແນະນໍາວ່າໃນລະບົບນີ້ພວກເຂົາສົ່ງເສີມການແຍກໄລຍະໂດຍຜ່ານຜົນກະທົບທີ່ແອອັດຂອງ macromolecular, ເນື່ອງຈາກວ່າ PEG ແມ່ນຕົວແທນການຝູງຊົນທີ່ມີຄວາມຫມັ້ນຄົງພິເສດ, ດັ່ງທີ່ເຫັນຢູ່ໃນລະບົບ LLP ອື່ນໆ33,34.ຢອດທີ່ອຸດົມດ້ວຍທາດໂປຼຕີນເຫຼົ່ານີ້ມີຄວາມອ່ອນໄຫວຕໍ່ກັບ NaCl (1 M) ແຕ່ບໍ່ແມ່ນເຖິງ 1,6-HD (10% v/v), ຢືນຢັນຄຸນສົມບັດ electrostatic ຂອງເຂົາເຈົ້າ (ຕື່ມ Fig. 2a, b).ພຶດຕິກໍາຂອງນ້ໍາຂອງພວກເຂົາໄດ້ຮັບການຢືນຢັນໂດຍການສັງເກດເບິ່ງເຫດການ droplet ປະສົມປະສານ millisecond ໂດຍໃຊ້ກ້ອງຈຸລະທັດ BF (ຮູບ 2b).
ຮູບພາບກ້ອງຈຸລະທັດ Confocal (CF) ຂອງ αS/Tau441 coacervates ໃນ LLPS buffer (10 μM ຂອງແຕ່ລະທາດໂປຼຕີນ, 0.5 μM ຂອງ αS ທີ່ມີປ້າຍກຳກັບ AF488 ແລະ Atto647N-labeled Tau441).b ຕົວແທນຄວາມແຕກຕ່າງລະຫວ່າງການແຊກແຊງທາງກົງກັນຂ້າມ (DIC) ຂອງ αS/Tau441 droplet fusion ເຫດການ (10 μMສໍາລັບແຕ່ລະທາດໂປຼຕີນ).c ແຜນວາດໄລຍະທີ່ອີງໃສ່ການກະແຈກກະຈາຍຂອງແສງສະຫວ່າງ (ຢູ່ທີ່ 350 nm) ຂອງ Tau441 LLPS (0–15 µM) ໃນການຂາດ (ຊ້າຍ) ຫຼືມີ (ຂວາ) ຂອງ 50 µM αS.ສີທີ່ອົບອຸ່ນສະແດງເຖິງການກະແຈກກະຈາຍຫຼາຍຂຶ້ນ.d ການກະແຈກກະຈາຍແສງສະຫວ່າງຂອງຕົວຢ່າງ αS/Tau441 LLPS ດ້ວຍການເພີ່ມຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ αS (Tau441 ທີ່ 5 µM, N = 2–3 ການຄ້າງຫ້ອງຕົວຢ່າງຕາມທີ່ລະບຸ).e Schematic ເປັນຕົວແທນຂອງບາງຊະນິດຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ tau ແລະພາກພື້ນທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ໃຊ້ໃນການສຶກສານີ້: ໂດເມນ N-terminal ທີ່ຖືກຄິດຄ່າທໍານຽມທາງລົບ (ສີແດງ), ພາກພື້ນທີ່ອຸດົມສົມບູນ proline (ສີຟ້າ), ໂດເມນ microtubule-binding (MTBD, ເນັ້ນໃສ່ສີສົ້ມ), ແລະ. ກ້ຽວວຽນຄູ່ສ້າງ amyloid.ພາກພື້ນ filament (PHF) ຕັ້ງຢູ່ພາຍໃນ MTBD (ສີຂີ້ເຖົ່າ).ແຜນທີ່ການເກັບຄ່າສຸດທິຕໍ່ Residue (NCPR) ຂອງ Tau441 ຖືກສະແດງ.f ການໃຊ້ 1 µM AF488-labeled αS ແລະ Atto647N-labeled ΔNt-, ການນໍາໃຊ້ 1 µM AF488-labeled αS ຫຼື ΔCt-αS ໃນທີ່ປະທັບຂອງ ΔNt-Tau (ເທິງ, 10 µM ຕໍ່ທາດໂປຼຕີນ) ຫຼື K18 (μM, ລຸ່ມສຸດ, 50 µM. ) ) ) micrographs ຂອງ WF condensed ໃນ LLPS ຫຼື K18 buffer.ແຖບຂະໜາດໃນຮູບໜຶ່ງສະແດງເຖິງຂະໜາດຂອງຮູບທັງໝົດໃນແຜງໜຶ່ງ (20 µm ສຳລັບແຜງ a, b ແລະ f).ຂໍ້ມູນດິບສຳລັບແຜງ c ແລະ d ແມ່ນສະໜອງເປັນໄຟລ໌ຂໍ້ມູນດິບ.
ເພື່ອທົດສອບບົດບາດຂອງ αS ໃນຂະບວນການ LLPS ນີ້, ພວກເຮົາທໍາອິດໄດ້ສືບສວນຜົນກະທົບຂອງ αS ກ່ຽວກັບຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງ droplet ໂດຍ nephelometry ໂດຍໃຊ້ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ NaCl ເພີ່ມຂຶ້ນ (ຮູບ 2c).ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງເກືອໃນຕົວຢ່າງທີ່ມີ αS ສູງຂຶ້ນ, ຄ່າການກະແຈກກະຈາຍຂອງແສງສະຫວ່າງສູງຂຶ້ນ (ຢູ່ທີ່ 350 nm), ເຊິ່ງຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງບົດບາດສະຖຽນລະພາບຂອງ αS ໃນລະບົບ LLPS ນີ້.ຜົນກະທົບທີ່ຄ້າຍຄືກັນສາມາດສັງເກດເຫັນໄດ້ໂດຍການເພີ່ມຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງαS (ແລະເພາະສະນັ້ນອັດຕາສ່ວນ αS: Tau441) ປະມານ.ເພີ່ມຂຶ້ນ 10 ເທົ່າທຽບກັບຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ tau (5 µM) (ຮູບ 2d).ເພື່ອສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ αS ເປັນທາດໂປຼຕີນຈາກ scaffold ໃນ coacervates, ພວກເຮົາໄດ້ຕັດສິນໃຈສືບສວນພຶດຕິກໍາຂອງ LLPS-disrupted Tau mutant, ເຊິ່ງຂາດພື້ນທີ່ N-terminal ທີ່ຖືກຄິດຄ່າທໍານຽມທາງລົບ ( residues 1-150, ເບິ່ງຮູບ 2e) ເອີ້ນວ່າ ΔNt-Tau.WF microscopy ແລະ nephelometry ຢືນຢັນວ່າ ΔNt-Tau ຕົວຂອງມັນເອງບໍ່ໄດ້ຜ່ານ LLPS (ຮູບ 2f ແລະເພີ່ມເຕີມ Fig. 2d), ດັ່ງທີ່ໄດ້ລາຍງານກ່ອນຫນ້ານີ້ 14. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ເມື່ອ αS ຖືກເພີ່ມເຂົ້າໃນການແກ້ໄຂການກະຈາຍຂອງຕົວແປ Tau ທີ່ຖືກຕັດອອກນີ້, ຂະບວນການ LLPS ແມ່ນສົມບູນ. ຟື້ນຟູດ້ວຍຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງ droplet ໃກ້ກັບຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງ droplet ຂອງການແກ້ໄຂຂະຫນາດເຕັມຂອງ Tau ແລະ αS ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂທີ່ຄ້າຍຄືກັນແລະຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງທາດໂປຼຕີນ.ຂະບວນການນີ້ຍັງສາມາດສັງເກດເຫັນໄດ້ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂຂອງການແອອັດ macromolecular ຕ່ໍາ (ຕື່ມ Fig. 2c).ບົດບາດຂອງພາກພື້ນ αS ຂອງ C-terminal, ແຕ່ບໍ່ແມ່ນຄວາມຍາວທັງຫມົດ, ໃນຂະບວນການ LLPS ໄດ້ຖືກສະແດງໃຫ້ເຫັນໂດຍການຍັບຍັ້ງການສ້າງ droplet ໂດຍໃຊ້ຕົວແປ C-terminal αS ທີ່ຖືກຕັດຂາດສານຕົກຄ້າງ 104-140 (ຮູບ 1a) ຂອງ (ΔCt-. αS) ທາດໂປຼຕີນ (ຮູບ 2f ແລະເສີມ Fig. 2d).colocalization ຂອງ αS ແລະ ΔNt-Tau ໄດ້ຖືກຢືນຢັນໂດຍກ້ອງຈຸລະທັດ fluorescence confocal (ຕື່ມ Fig. 1b).
ເພື່ອທົດສອບກົນໄກ LLPS ຕື່ມອີກລະຫວ່າງ Tau441 ແລະ αS, ຕົວແປ Tau ເພີ່ມເຕີມໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້, ຄື fragment helical filament core (PHF) ຄູ່ຢູ່ໃນໂດເມນ microtubule-binding (MTBD), ເຊິ່ງຖ້າມັນມີສີ່ໂດເມນຊ້ໍາກັນ, ເປັນທີ່ຮູ້ຈັກທົ່ວໄປ. ເປັນຊິ້ນສ່ວນ K18 (ເບິ່ງຮູບ 2e).ບໍ່ດົນມານີ້, ມັນໄດ້ຖືກລາຍງານວ່າ αS ມັກຈະຜູກມັດກັບທາດໂປຼຕີນຈາກ tau ທີ່ຕັ້ງຢູ່ໃນໂດເມນທີ່ອຸດົມສົມບູນ proline ໃນລໍາດັບທີ່ນໍາຫນ້າໂດເມນ microtubule-binding.ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ພາກພື້ນ PHF ຍັງອຸດົມສົມບູນໄປດ້ວຍສານຕົກຄ້າງທີ່ມີຄ່າບວກ (ເບິ່ງຮູບ 2e), ໂດຍສະເພາະແມ່ນ lysine (15% residues), ເຊິ່ງກະຕຸ້ນໃຫ້ພວກເຮົາທົດສອບວ່າພາກພື້ນນີ້ຍັງປະກອບສ່ວນກັບການຂົ້ນຂອງສະລັບສັບຊ້ອນ αS / Tau.ພວກເຮົາສັງເກດເຫັນວ່າ K18 ຢ່າງດຽວບໍ່ສາມາດກະຕຸ້ນ LLPS ທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນເຖິງ 100 μM ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂທີ່ໄດ້ຮັບການທົດສອບ (LLPS buffer ກັບ 15% PEG ຫຼື 20% dextran) (ຮູບ 2f).ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ເມື່ອພວກເຮົາເພີ່ມ 50 µM αS ໄປຫາ 50 µM K18, ການສ້າງຢອດທາດໂປຼຕີນທີ່ປະກອບດ້ວຍ K18 ແລະ αS ຢ່າງໄວວາໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນໂດຍ nephelometry (ຮູບພາບເສີມ 2d) ແລະກ້ອງຈຸລະທັດ WF (ຮູບ 2f).ຕາມທີ່ຄາດໄວ້, ΔCt-αS ບໍ່ສາມາດຟື້ນຟູພຶດຕິກໍາ LLPS ຂອງ K18 (ຮູບ 2f).ພວກເຮົາສັງເກດວ່າການລວບລວມ αS/K18 ຕ້ອງການຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ສູງກວ່າເລັກນ້ອຍເພື່ອກະຕຸ້ນ LLPS ເມື່ອທຽບກັບ αS / ΔNt-Tau ຫຼື αS / Tau441, ສິ່ງອື່ນໆແມ່ນເທົ່າທຽມກັນ.ນີ້ແມ່ນສອດຄ່ອງກັບປະຕິສໍາພັນທີ່ເຂັ້ມແຂງຂອງພາກພື້ນ αS C-terminal ກັບໂດເມນ Tau proline ທີ່ອຸດົມສົມບູນເມື່ອທຽບກັບໂດເມນ microtubule-binding, ດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍກ່ອນຫນ້ານີ້ 31 .
ເນື່ອງຈາກ ΔNt-Tau ບໍ່ສາມາດປະຕິບັດ LLPS ໃນກໍລະນີທີ່ບໍ່ມີ αS, ພວກເຮົາໄດ້ເລືອກຕົວແປ Tau ນີ້ເປັນຕົວແບບສໍາລັບການກໍານົດລັກສະນະ αS / Tau LLPS ເນື່ອງຈາກຄວາມງ່າຍດາຍຂອງມັນຢູ່ໃນລະບົບ LLPS ທີ່ມີ Tau ເຕັມ (isotype, Tau441 / Tau441).ດ້ວຍຂະບວນການລວມທີ່ຊັບຊ້ອນ (heterotypic, αS/Tau441).ພວກເຮົາໄດ້ປຽບທຽບລະດັບການລວບລວມຂອງ αS (ເປັນສ່ວນຫນຶ່ງຂອງໂປຣຕີນໄລຍະ condensed, fαS, c) ໃນລະບົບ αS/Tau ແລະ αS/ΔNt-Tau ໂດຍການວິເຄາະ centrifugation ແລະໄລຍະກະຈາຍ SDS-PAGE (ເບິ່ງ 2e), ພົບເຫັນຄ່າທີ່ຄ້າຍຄືກັນຫຼາຍ. ສໍາລັບທາດໂປຼຕີນທັງຫມົດຢູ່ໃນຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນດຽວກັນ.ໂດຍສະເພາະ, ພວກເຮົາໄດ້ຮັບ fαS,c 84 ± 2% ແລະ 79 ± 7% ສໍາລັບ αS / Tau ແລະ αS / ΔNt-Tau, ຕາມລໍາດັບ, ແນະນໍາວ່າປະຕິສໍາພັນ heterotypic ລະຫວ່າງ αS ແລະ tau ແມ່ນດີກວ່າປະຕິສໍາພັນລະຫວ່າງໂມເລກຸນ tau.ລະຫວ່າງ.
ປະຕິສໍາພັນກັບ polycations ຕ່າງໆແລະຜົນກະທົບຂອງຂະບວນການ condensation ໃນ αS kinetics ໄດ້ຖືກສຶກສາຄັ້ງທໍາອິດໂດຍການຟື້ນຟູ fluorescence ຫຼັງຈາກ photobleaching (FRAP).ພວກເຮົາໄດ້ທົດສອບ αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau ແລະ αS/pLK coacervates (100 μM αS ເສີມດ້ວຍ 2 μM αS AF488-αS ແລະ 100 μM Tau441 ຫຼື ΔNt-Tau ຫຼື 1 mM pLK).ຂໍ້ມູນໄດ້ຮັບພາຍໃນ 30 ນາທີທໍາອິດຫຼັງຈາກປະສົມອົງປະກອບຕົວຢ່າງ.ຈາກຮູບພາບ FRAP ຕົວແທນ (ຮູບ 3a, αS/Tau441 condensation) ແລະເສັ້ນໂຄ້ງຂອງຫຼັກສູດທີ່ໃຊ້ເວລາທີ່ສອດຄ້ອງກັນຂອງພວກເຂົາ (ຮູບ 3b, ຮູບທີ່ 3 ເພີ່ມເຕີມ), ມັນສາມາດເຫັນໄດ້ວ່າ αS kinetics ແມ່ນຄ້າຍຄືກັນກັບຂອງ Tau441 coacervates.ແລະ ΔNt-Tau, ເຊິ່ງໄວກວ່າກັບ pLK.ຄ່າສໍາປະສິດການແຜ່ກະຈາຍທີ່ຄິດໄລ່ສໍາລັບ αS ພາຍໃນ coacervate ຕາມ FRAP (ຕາມທີ່ອະທິບາຍໂດຍ Kang et al. 35) ແມ່ນ D = 0.013 ± 0.009 µm2/s ແລະ D = 0.026 ± 0.008 µm2/s ສໍາລັບ αS/tau/Tau4/s. ລະບົບ αS/.pLK, Tau, ແລະ D = 0.18 ± 0.04 µm2/s, ຕາມລໍາດັບ (ຮູບ 3c).ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ຄ່າສໍາປະສິດການແຜ່ກະຈາຍ αS ໃນໄລຍະການກະແຈກກະຈາຍແມ່ນຫຼາຍຄໍາສັ່ງຂອງຂະຫນາດທີ່ສູງກວ່າໄລຍະ condensed ທັງຫມົດ, ຕາມການກໍານົດໂດຍ Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS, ເບິ່ງເພີ່ມເຕີມ Fig. 3) ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂດຽວກັນ (LLPS buffer) ແຕ່ໃນການຂາດ polycations. ( D = 8 ± 4 µm2/s ).ດັ່ງນັ້ນ, kinetics ຂອງການແປພາສາ αS ແມ່ນຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນ coacervates ເມື່ອທຽບກັບທາດໂປຼຕີນໃນໄລຍະທີ່ກະແຈກກະຈາຍເນື່ອງຈາກຜົນກະທົບຂອງໂມເລກຸນທີ່ຊັດເຈນ, ເຖິງແມ່ນວ່າ coacervates ທັງຫມົດຈະຮັກສາຄຸນສົມບັດຄ້າຍຄືຂອງແຫຼວໃນຊ່ວງເຄິ່ງຊົ່ວໂມງທໍາອິດຫຼັງຈາກການສ້າງຕັ້ງ, ກົງກັນຂ້າມກັບໄລຍະ tau.kinetics ໄວຂຶ້ນໃນ pLK condensate.
a–c ການວິເຄາະ FRAP ຂອງ αS dynamics (2% AF488-labeled αS) ໃນ electrostatic coacervates.ຮູບພາບທີ່ເປັນຕົວແທນຂອງການວິເຄາະ αS/Tau441 FRAP ໃນ triplicate ແມ່ນສະແດງຢູ່ໃນ (a), ບ່ອນທີ່ວົງສີແດງຊີ້ໃຫ້ເຫັນພື້ນທີ່ decolorized.ແຖບຂະຫນາດແມ່ນ 5 µm.b ເສັ້ນໂຄ້ງ FRAP ສະເລ່ຍ ແລະ (c) ຄ່າສໍາປະສິດການແຜ່ກະຈາຍ (D) ທີ່ຄິດໄລ່ສໍາລັບ 5–6 (N) droplets ທີ່ແຕກຕ່າງກັນຈາກສາມການທົດລອງໂດຍໃຊ້ 100 µM αS ແລະຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ Tau441 (ສີແດງ) ຫຼື ΔNt-Tau (ສີຟ້າ) ຫຼື pLK (ສີຂຽວ) ໃນສິບເທົ່າຂອງຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ LLPS.ການບ່ຽງເບນມາດຕະຖານຂອງເສັ້ນໂຄ້ງ FRAP ແມ່ນສະແດງເປັນສີທີ່ມີຮົ່ມ.ສໍາລັບການປຽບທຽບ, ຄ່າສໍາປະສິດການແຜ່ກະຈາຍ αS ໃນໄລຍະການກະແຈກກະຈາຍໄດ້ຖືກກໍານົດເປັນ triplicate ໂດຍໃຊ້ fluorescence correlation spectroscopy (FCS) (ເບິ່ງຮູບເສີມ 3 ແລະວິທີການສໍາລັບຂໍ້ມູນເພີ່ມເຕີມ).d ຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ X-band EPR spectra ຂອງ 100 μM TEMPOL-122-αS ໃນ LLPS buffer ໂດຍບໍ່ມີການ polycation ໃດໆ (ສີດໍາ) ຫຼືຢູ່ໃນທີ່ປະທັບຂອງ 100 μM Tau441 (ສີແດງ) ຫຼື ΔNt-Tau (ສີຟ້າ) ຫຼື 1 mM pLK (ສີຂຽວ).inset ສະແດງໃຫ້ເຫັນທັດສະນະທີ່ກວ້າງຂວາງຂອງເສັ້ນພາກສະຫນາມທີ່ເຂັ້ມແຂງທີ່ມີການປ່ຽນແປງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍທີ່ສຸດເກີດຂຶ້ນ.e ການຜູກມັດເສັ້ນໂຄ້ງຂອງ 50 μM TEMPOL-122-αS ກັບ polycations ຕ່າງໆໃນການຂາດ LLPS (ບໍ່ມີ PEG).ຄວາມກວ້າງໃຫຍ່ຂອງແຖບ III ຫຼຸດລົງເມື່ອປຽບທຽບກັບແຖບ II (IIII / III) ຂອງສະເປກຕາ EPR ປົກກະຕິແມ່ນສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງການເພີ່ມອັດຕາສ່ວນ molar ຂອງ Tau441 (ສີແດງ), ΔNt-Tau (ສີຟ້າ) ແລະ pLK (ສີຂຽວ).ເສັ້ນສີສະແດງໃຫ້ເຫັນພໍດີກັບຂໍ້ມູນໂດຍໃຊ້ຕົວແບບການຜູກມັດແບບຫຍາບໆທີ່ມີສະຖານທີ່ຜູກມັດທີ່ຄືກັນ ແລະເປັນເອກະລາດໃນແຕ່ລະເສັ້ນໂຄ້ງ.ຂໍ້ມູນດິບແມ່ນສະຫນອງໃຫ້ໃນຮູບແບບຂອງໄຟລ໌ຂໍ້ມູນດິບ.
ເປັນການເສີມ, ພວກເຮົາໄດ້ສືບສວນການເຄື່ອນໄຫວຂອງ αS ໃນ coacervates ຕ່າງໆໂດຍນໍາໃຊ້ການຕິດສະຫຼາກ spin directed (SDSL) ແລະການຕໍ່ເນື່ອງ electron paramagnetic resonance (CW-EPR).ວິທີການນີ້ໄດ້ພິສູດໃຫ້ເຫັນວ່າເປັນປະໂຫຍດຫຼາຍໃນການລາຍງານຄວາມຍືດຫຍຸ່ນແລະການເຄື່ອນໄຫວຂອງ IDP ທີ່ມີຄວາມລະອຽດທີ່ເຫລືອຢູ່ທີ່ແທ້ຈິງ36,37,38.ເພື່ອເຮັດສິ່ງນີ້, ພວກເຮົາໄດ້ສ້າງສານຕົກຄ້າງຂອງ cysteine ​​​​ໃນ mutants Cys ດຽວແລະນໍາໃຊ້ 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) spin probe.Maleimide derivatives ຕິດປ້າຍໃຫ້ເຂົາເຈົ້າ.ໂດຍສະເພາະ, ພວກເຮົາໄດ້ໃສ່ TEMPOL probes ຢູ່ຕໍາແຫນ່ງ 122 ຫຼື 24 αS (TEMPOL-122-αS ແລະ TEMPOL-24-αS).ໃນກໍລະນີທໍາອິດ, ພວກເຮົາກໍານົດເປົ້າຫມາຍຂອງພາກພື້ນ C-terminal ຂອງທາດໂປຼຕີນ, ເຊິ່ງມີສ່ວນຮ່ວມໃນການໂຕ້ຕອບກັບ polycations.ແທນທີ່ຈະ, ຕໍາແຫນ່ງ 24 ສາມາດໃຫ້ພວກເຮົາຂໍ້ມູນກ່ຽວກັບການເຄື່ອນໄຫວໂດຍລວມຂອງທາດໂປຼຕີນໃນ condensate.ໃນທັງສອງກໍລະນີ, ສັນຍານ EPR ທີ່ໄດ້ຮັບສໍາລັບທາດໂປຼຕີນຂອງໄລຍະການກະແຈກກະຈາຍແມ່ນກົງກັນກັບຮາກ nitroxide ໃນສະພາບການເຄື່ອນຍ້າຍໄວ.ຫຼັງຈາກການແຍກໄລຍະໃນການປະກົດຕົວຂອງ tau ຫຼື pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 ຫຼື ΔNt-Tau ໃນອັດຕາສ່ວນ 1: 1 ຫຼື pLK ໃນອັດຕາສ່ວນ 1: 10), ການເພີ່ມຂື້ນຂອງຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງຈຸດສູງສຸດແມ່ນສັງເກດເຫັນໃນ EPR spectrum ຂອງαS.ເສັ້ນການສູນເສຍຂະຫຍາຍກວ້າງຂຶ້ນ, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນການຫຼຸດລົງຂອງ αS reorientation kinetics ໃນ droplets ເມື່ອທຽບກັບທາດໂປຼຕີນໃນໄລຍະ dilute (ຮູບ 3d, ເພີ່ມເຕີມ Fig. 4a).ການປ່ຽນແປງເຫຼົ່ານີ້ແມ່ນຊັດເຈນກວ່າຢູ່ໃນຕໍາແຫນ່ງ 122. ໃນຂະນະທີ່ຢູ່ຕໍາແຫນ່ງ 24 ການປະກົດຕົວຂອງ pLK ບໍ່ໄດ້ສົ່ງຜົນກະທົບຕໍ່ kinetics ຂອງ probe, ຢູ່ຕໍາແຫນ່ງ 122 ຮູບຮ່າງຂອງເສັ້ນ spectral ມີການປ່ຽນແປງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (ຮູບພາບເສີມ 4a).ເມື່ອພວກເຮົາພະຍາຍາມສ້າງແບບຈໍາລອງ spectra ຢູ່ຕໍາແຫນ່ງ 122 ຂອງສອງລະບົບ αS/polycation ໂດຍໃຊ້ຕົວແບບ isotropic (ຮູບເສີມ 5a) ທີ່ໃຊ້ທົ່ວໄປເພື່ອອະທິບາຍເຖິງການເຄື່ອນທີ່ຂອງສະປິນທີ່ມີປ້າຍກຳກັບ IDP38,39, ພວກເຮົາບໍ່ສາມາດສ້າງຕົວແບບທົດລອງຄືນໃໝ່ໄດ້..ການຈໍາລອງ Spectral ຂອງຕໍາແຫນ່ງຂອງ 24 spin contrasts (ຕື່ມ Fig. 5a).ນີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າມີຕໍາແຫນ່ງພິເສດໃນພື້ນທີ່ຂອງການຕັ້ງຄ່າ spin ຂອງພາກພື້ນ C-terminal ຂອງαS ໃນທີ່ປະທັບຂອງ polycations.ເມື່ອພິຈາລະນາສ່ວນຫນຶ່ງຂອງ αS ໃນໄລຍະການຂົ້ນພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂ EPR ທົດລອງ (84 ± 2%, 79 ± 7%, ແລະ 47 ± 4% ສໍາລັບ αS / Tau441, αS / ΔNt-Tau, ແລະ αS / pLK, ຕາມລໍາດັບ - ເບິ່ງການເສີມ Fig. 2e ຂອງການວິເຄາະຂໍ້ມູນ c), ມັນສາມາດເຫັນໄດ້ວ່າການຂະຫຍາຍທີ່ກວດພົບໂດຍວິທີການ EPR ສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນສະທ້ອນໃຫ້ເຫັນເຖິງປະຕິສໍາພັນຂອງພາກພື້ນ C-terminal αS ກັບ polycations ຕ່າງໆໃນໄລຍະ condensed (ການປ່ຽນແປງຕົ້ນຕໍໃນເວລາທີ່ນໍາໃຊ້ TEMPOL-122-. αS), ແລະບໍ່ແມ່ນການຂົ້ນຂອງທາດໂປຼຕີນ.ການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງ microviscosity ແມ່ນສັງເກດເຫັນຢູ່ໃນ probe.ຕາມທີ່ຄາດໄວ້, EPR spectrum ຂອງທາດໂປຼຕີນພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂອື່ນນອກເຫນືອຈາກ LLPS ໄດ້ຖືກຟື້ນຟູຢ່າງສົມບູນເມື່ອ 1 M NaCl ໄດ້ຖືກເພີ່ມເຂົ້າໃນການປະສົມ (ຮູບພາບເສີມ 4b).ໂດຍລວມ, ຂໍ້ມູນຂອງພວກເຮົາແນະນໍາວ່າການປ່ຽນແປງທີ່ກວດພົບໂດຍ CW-EPR ສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນສະທ້ອນໃຫ້ເຫັນເຖິງການໂຕ້ຕອບຂອງພາກພື້ນ C-terminal ຂອງαS ກັບ polycations ຕ່າງໆໃນໄລຍະ condensed, ແລະການໂຕ້ຕອບນີ້ເບິ່ງຄືວ່າມີຄວາມເຂັ້ມແຂງກັບ pLK ຫຼາຍກ່ວາ Tau.
ເພື່ອໃຫ້ໄດ້ຮັບຂໍ້ມູນໂຄງສ້າງເພີ່ມເຕີມກ່ຽວກັບທາດໂປຼຕີນໃນ coacervate, ພວກເຮົາໄດ້ຕັດສິນໃຈສຶກສາລະບົບ LLPS ໂດຍໃຊ້ NMR ໃນການແກ້ໄຂ.ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ພວກເຮົາສາມາດກວດພົບພຽງແຕ່ສ່ວນຫນຶ່ງຂອງ αS ທີ່ຍັງເຫຼືອຢູ່ໃນໄລຍະການກະແຈກກະຈາຍ, ເຊິ່ງອາດຈະເປັນຍ້ອນການຫຼຸດລົງຂອງທາດໂປຼຕີນພາຍໃນ coacervate ແລະໄລຍະທີ່ຫນາແຫນ້ນຢູ່ດ້ານລຸ່ມຂອງການແກ້ໄຂໃນການວິເຄາະ NMR.ເມື່ອພວກເຮົາວິເຄາະໂຄງສ້າງແລະການເຄື່ອນໄຫວຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ຍັງເຫຼືອຢູ່ໃນຂັ້ນຕອນການກະແຈກກະຈາຍຂອງຕົວຢ່າງ LLPS ໂດຍໃຊ້ NMR (Supplementary Fig. 5c, d), ພວກເຮົາສັງເກດເຫັນວ່າທາດໂປຼຕີນປະຕິບັດເກືອບຄືກັນຢູ່ໃນທີ່ປະທັບຂອງ pLK ແລະ ΔNt-Tau, ທັງສອງ. ເຊິ່ງຢູ່ໃນໂຄງສ້າງຂັ້ນສອງແລະການເຄື່ອນໄຫວຂອງກະດູກສັນຫຼັງຂອງທາດໂປຼຕີນ, ເປີດເຜີຍໂດຍການທົດລອງກ່ຽວກັບການປ່ຽນແປງທາງເຄມີຂັ້ນສອງແລະການຜ່ອນຄາຍ R1ρ.ຂໍ້ມູນ NMR ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ C-terminus ຂອງ αS ທົນທຸກການສູນເສຍຄວາມຍືດຫຍຸ່ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນຂະນະທີ່ຮັກສາລັກສະນະທີ່ບໍ່ເປັນລະບຽບຂອງມັນ, ເຊັ່ນດຽວກັບສ່ວນທີ່ເຫລືອຂອງລໍາດັບທາດໂປຼຕີນ, ເນື່ອງຈາກການໂຕ້ຕອບຂອງມັນກັບ polycations.
ນັບຕັ້ງແຕ່ການຂະຫຍາຍສັນຍານ CW-EPR ສັງເກດເຫັນຢູ່ໃນໄລຍະ condensed TEMPOL-122-αS ສະທ້ອນໃຫ້ເຫັນປະຕິສໍາພັນຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ມີ polycations, ພວກເຮົາໄດ້ດໍາເນີນການ titration EPR ເພື່ອປະເມີນຄວາມຜູກພັນຂອງ αS ກັບ polycations ຕ່າງໆໃນການຂາດ LLPS (ບໍ່ມີການສະສົມຂອງ. Buffer LLPS), ແນະນໍາວ່າປະຕິສໍາພັນແມ່ນຄືກັນໃນໄລຍະເຈືອຈາງແລະເຂັ້ມຂຸ້ນ (ເຊິ່ງໄດ້ຮັບການຢືນຢັນໂດຍຂໍ້ມູນຂອງພວກເຮົາ, ຂໍ້ມູນເສີມ Fig. 4a ແລະ Supplementary Fig. 6).ເປົ້າຫມາຍແມ່ນເພື່ອເຂົ້າໄປເບິ່ງວ່າ coacervates ທັງຫມົດ, ເຖິງວ່າຈະມີຄຸນສົມບັດຄ້າຍຄືນ້ໍາທົ່ວໄປ, ສະແດງໃຫ້ເຫັນພຶດຕິກໍາຄວາມແຕກຕ່າງທີ່ຕິດພັນໃນລະດັບໂມເລກຸນ.ຕາມທີ່ຄາດໄວ້, EPR spectrum ຂະຫຍາຍອອກໄປດ້ວຍຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ polycation ທີ່ເພີ່ມຂຶ້ນ, ສະທ້ອນໃຫ້ເຫັນເຖິງການຫຼຸດລົງຂອງຄວາມຍືດຫຍຸ່ນຂອງໂມເລກຸນເນື່ອງຈາກການພົວພັນລະຫວ່າງໂມເລກຸນຂອງຄູ່ຮ່ວມປະຕິສໍາພັນທັງຫມົດເກືອບເຖິງການອີ່ມຕົວ (ຮູບ 3e, ເພີ່ມເຕີມ Fig. 6).pLK ບັນລຸຄວາມອີ່ມຕົວນີ້ໃນອັດຕາສ່ວນ molar ຕ່ໍາ (polycation:αS) ເມື່ອທຽບກັບ ΔNt-Tau ແລະ Tau441.ໃນຄວາມເປັນຈິງ, ການປຽບທຽບຂໍ້ມູນກັບຮູບແບບການຜູກມັດໂດຍປະມານທີ່ສົມມຸດວ່າສະຖານທີ່ຜູກມັດທີ່ຄືກັນແລະເປັນເອກະລາດໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການແຍກຕົວຄົງທີ່ປາກົດຂື້ນຂອງ pLK (~5 μM) ແມ່ນຄໍາສັ່ງຂອງຂະຫນາດຕ່ໍາກວ່າ Tau441 ຫຼື ΔNt-Tau (~50 μM. ).µM).ເຖິງແມ່ນວ່ານີ້ແມ່ນການຄາດຄະເນທີ່ຫຍາບຄາຍ, ນີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ αS ມີຄວາມໃກ້ຊິດທີ່ສູງກວ່າສໍາລັບ polycations ທີ່ງ່າຍດາຍທີ່ມີພາກພື້ນທີ່ມີຄ່າບວກຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ.ເນື່ອງຈາກຄວາມແຕກຕ່າງນີ້ໃນຄວາມໃກ້ຊິດລະຫວ່າງ αS ແລະ polycations ຕ່າງໆ, ພວກເຮົາສົມມຸດວ່າຄຸນສົມບັດຂອງແຫຼວຂອງພວກມັນອາດຈະປ່ຽນແປງແຕກຕ່າງກັນໃນໄລຍະເວລາແລະດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງທົນທຸກຈາກຂະບວນການ LSPT ທີ່ແຕກຕ່າງກັນ.
ເນື່ອງຈາກສະພາບແວດລ້ອມທີ່ແອອັດສູງພາຍໃນທາດໂປຼຕີນຈາກ coacervate ແລະລັກສະນະ amyloid ຂອງທາດໂປຼຕີນ, ພວກເຮົາໄດ້ສັງເກດເຫັນພຶດຕິກໍາຂອງ coacervate ໃນໄລຍະເວລາເພື່ອກວດພົບຂະບວນການ LSPT ທີ່ເປັນໄປໄດ້.ການນໍາໃຊ້ກ້ອງຈຸລະທັດ BF ແລະ CF (ຮູບທີ 4), ພວກເຮົາສັງເກດເຫັນວ່າ αS/Tau441 coacervates ໃນຂອບເຂດຂະຫນາດໃຫຍ່ໃນການແກ້ໄຂ, ປະກອບເປັນ droplets ຂະຫນາດໃຫຍ່ທີ່ຕິດຕໍ່ແລະຊຸ່ມຢູ່ດ້ານລຸ່ມຂອງດີ / ເລື່ອນເປັນ droplets ເຕັມ, ຕາມທີ່ຄາດໄວ້ (ຮູບເພີ່ມເຕີມ .7d);ພວກ​ເຮົາ​ເອີ້ນ​ໂຄງ​ສ້າງ​ລຸ່ມ​ສຸດ​ເຫຼົ່າ​ນີ້ "rafts ທາດ​ໂປຼ​ຕີນ​"​.ໂຄງສ້າງເຫຼົ່ານີ້ຍັງຄົງມີນ້ໍາຍ້ອນວ່າພວກເຂົາຮັກສາຄວາມສາມາດໃນການ fuse (ຕື່ມ Fig. 7b) ແລະສາມາດເຫັນໄດ້ເປັນເວລາຫຼາຍຊົ່ວໂມງຫຼັງຈາກ LLPS ຖືກກະຕຸ້ນ (ຮູບ 4 ແລະຮູບພາບເສີມ 7c).ພວກເຮົາສັງເກດເຫັນວ່າຂະບວນການປຽກຊຸ່ມແມ່ນໄດ້ຮັບການເອື້ອອໍານວຍໃນດ້ານຂອງ hydrophilic ຫຼາຍກ່ວາອຸປະກອນການ hydrophobic (ຕື່ມຂໍ້ມູນໃສ່ Fig. 7a), ຄາດວ່າສໍາລັບການ coacervates electrostatic ກັບຄ່າບໍລິການທີ່ບໍ່ສົມດູນແລະດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງມີທ່າແຮງດ້ານ electrostatic ສູງ.ໂດຍສະເພາະ, αS/ΔNt-Tau coalescence ແລະ rafting ໄດ້ຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ, ໃນຂະນະທີ່ αS/pLK condensates ຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (ຮູບ 4).ໃນຊ່ວງເວລາບວມສັ້ນ, ຢອດ αS/pLK ສາມາດປະສົມເຂົ້າກັນໄດ້ ແລະ ຊຸ່ມຊື່ນກັບພື້ນຜິວນ້ຳ, ແຕ່ຂະບວນການນີ້ຢຸດເຊົາຢ່າງໄວວາ ແລະ ພາຍຫຼັງ 5 ຊົ່ວໂມງຂອງການຝັກ, ມີພຽງແຕ່ເຫດການປະສົມກັນທີ່ຈຳກັດ ແລະ ບໍ່ສັງເກດເຫັນການປຽກຊຸ່ມ.– ການ​ປ່ຽນ​ແປງ gel-drip​.
ຕົວແທນ BF (ແຜງສີເທົາ) ແລະ CF (ແຜງດ້ານຂວາ, AF488-ປ້າຍ αS ໃນສີຂຽວ) ຂອງຕົວຢ່າງ coacervate ທີ່ມີ 100 µM αS (1% ປ້າຍ fluorescent) ໃນ LLPS buffer ໃນທີ່ປະທັບຂອງ 100 µM Tau441 (ເທິງ) fluorescence microspicence) -Tau (ກາງ) ຫຼື 1 mM pLK (ລຸ່ມ) ໃນເວລາ incubation ທີ່ແຕກຕ່າງກັນແລະຄວາມສູງໂຟກັສ (z, ໄລຍະຫ່າງຈາກລຸ່ມຂອງແຜ່ນໄດ້ດີ).ການທົດລອງໄດ້ຖືກເຮັດຊ້ໍາອີກ 4-6 ຄັ້ງໂດຍເອກະລາດເຊິ່ງກັນແລະກັນດ້ວຍຜົນໄດ້ຮັບດຽວກັນ.αS/Tau441 coacervates ແມ່ນ wetted ຫຼັງຈາກ 24 ຊົ່ວໂມງ, ກອບເປັນຈໍານວນ rafts ຂະຫນາດໃຫຍ່ກ່ວາຮູບ.ແຖບຂະຫນາດສໍາລັບຮູບພາບທັງຫມົດແມ່ນ 20 µm.
ຫຼັງຈາກນັ້ນພວກເຮົາໄດ້ຖາມວ່າສະນຸກເກີທາດໂປຼຕີນທີ່ມີນ້ໍາຂະຫນາດໃຫຍ່ທີ່ສ້າງຂຶ້ນໃນ αS/Tau441 LLPS ຈະນໍາໄປສູ່ການລວບລວມ amyloid ຂອງທາດໂປຼຕີນໃດໆທີ່ສຶກສາ.ພວກເຮົາປະຕິບັດຕາມການຈະເລີນເຕີບໂຕຂອງ αS/Tau441 droplets ໃນໄລຍະເວລາດ້ວຍກ້ອງຈຸລະທັດ WF ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂດຽວກັນກັບຂ້າງເທິງ, ແຕ່ໃຊ້ 1 μM AF488-labeled αS ແລະ Atto647N-labeled Tau441 (ຮູບ 5a).ດັ່ງທີ່ຄາດໄວ້, ພວກເຮົາສັງເກດເຫັນການເຮັດໃຫ້ທາດໂປຼຕີນທີ່ສົມບູນຕະຫຼອດຂະບວນການໃຫຍ່ເຕັມຕົວ.ຫນ້າສົນໃຈ, ຈາກ ca.ຫຼັງຈາກ 5 ຊົ່ວໂມງ, ໂຄງສ້າງທີ່ບໍ່ເປັນວົງກົມທີ່ເຂັ້ມຂຸ້ນໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນພາຍໃນ rafts, ເຊິ່ງພວກເຮົາເອີ້ນວ່າ "ຈຸດ", ເຊິ່ງບາງອັນໄດ້ຖືກ colocalized ດ້ວຍ αS, ແລະບາງອັນໄດ້ຖືກປັບປຸງໃນ Tau441 (ຮູບ 5a, ລູກສອນສີຂາວ).ຈຸດເຫຼົ່ານີ້ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນສະເຫມີຢູ່ໃນ rafts ໃນຂອບເຂດທີ່ໃຫຍ່ກວ່າສໍາລັບ αS / ΔNt-Tau ກ່ວາ αS / ΔNt-Tau.ບໍ່ມີຈຸດທີ່ແຕກຕ່າງຂອງຢອດຂອງລະບົບ pLK ແລະ Tau ທີ່ບໍ່ມີຄວາມສາມາດໃນການ fusion/wetting.ເພື່ອທົດສອບວ່າຮອຍເປື້ອນເຫຼົ່ານີ້ມີ αS ແລະ Tau441 ເປັນການລວມຕົວຄ້າຍຄື amyloid, ພວກເຮົາໄດ້ເຮັດການທົດລອງທີ່ຄ້າຍຄືກັນໂດຍໃຊ້ CF microscopy ເຊິ່ງ Tau441 ໄດ້ຖືກຕິດສະຫຼາກດ້ວຍ Atto647N ແລະ 12.5 μM amyloid-specific thioflavin-T (ThT) ໄດ້ຖືກເພີ່ມຕັ້ງແຕ່ເລີ່ມຕົ້ນ.ສີຍ້ອມ.ເຖິງແມ່ນວ່າການຕົກຄ້າງຂອງ ThT ຂອງ αS/Tau441 droplets ຫຼື rafts ບໍ່ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນເຖິງແມ່ນວ່າຫຼັງຈາກ 24 ຊົ່ວໂມງຂອງການ incubation (ຮູບ 5b, ແຖວເທິງ - droplets ທີ່ຍັງເຫຼືອຢູ່ໃນໄລຍະ rafts ທາດໂປຼຕີນ), ThT-positive ໂຄງສ້າງທີ່ມີ Atto647N-Tau441 ພາຍໃນ rafts ແມ່ນອ່ອນແອຫຼາຍ.ນີ້ replicates ຂະຫນາດ, ຮູບຮ່າງ, ແລະສະຖານທີ່ຂອງຈຸດທີ່ອະທິບາຍກ່ອນຫນ້ານີ້ (ຮູບ 5b, ແຖວກາງແລະລຸ່ມ), ແນະນໍາວ່າຈຸດດັ່ງກ່າວອາດຈະສອດຄ່ອງກັບການລວບລວມຂອງ amyloid ປະກອບໃນ coacervates ນ້ໍາ aging.
WF 25 μM αS ໃນເວລາ incubation ຕ່າງໆແລະຄວາມສູງໂຟກັສ (z, ໄລຍະຫ່າງຈາກລຸ່ມ unbound) ໃນທີ່ປະທັບຂອງ 25 μM Tau441 (1 μM AF488-labeled αS ແລະ Atto647N-labeled Tau441) ໃນດີຂອງແຜ່ນກ້ອງຈຸລະທັດທີ່ມີ LLPS buffer) .ຫົກການທົດລອງໄດ້ຖືກເຮັດຊ້ໍາອີກຄັ້ງໂດຍມີຜົນໄດ້ຮັບທີ່ຄ້າຍຄືກັນ.b CF ຮູບພາບກ້ອງຈຸລະທັດຂອງ 25 μM αS ຢູ່ໃນທີ່ປະທັບຂອງ 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-labeled Tau441) ແລະ 12.5 μM thioflavin-T (ThT).ຢອດທາດໂປຼຕີນທີ່ມີນ້ໍາຫນັກແລະ rafts ທາດໂປຼຕີນທີ່ຝາກໄວ້ແລະຈຸດແມ່ນສະແດງຢູ່ໃນແຖວເທິງແລະກາງ, ຕາມລໍາດັບ.ແຖວລຸ່ມສະແດງໃຫ້ເຫັນຮູບພາບຂອງ rafts ແລະການຫຼຸດລົງຈາກ 3 replicates ເອກະລາດ.ລູກສອນສີຂາວຊີ້ບອກຈຸດ ThT-positive ໃນທັງສອງແຜງ.ແຖບຂະຫນາດສໍາລັບຮູບພາບທັງຫມົດແມ່ນ 20 µm.
ເພື່ອກວດສອບລາຍລະອຽດເພີ່ມເຕີມຂອງການປ່ຽນແປງຂອງເຄືອຂ່າຍທາດໂປຼຕີນຈາກ coacervate ໃນລະຫວ່າງການປ່ຽນຈາກຂອງແຫຼວໄປສູ່ຄວາມແຂງ, ພວກເຮົາໄດ້ນໍາໃຊ້ການຖ່າຍຮູບຕະຫຼອດຊີວິດຂອງ fluorescence (FLIM) ແລະ Förster resonance energy transfer microscopy (FRET) (ຮູບ 6 ແລະຕົວເລກເສີມ 8 ແລະ 9).ພວກເຮົາສົມມຸດຕິຖານວ່າການຈະເລີນເຕີບໂຕ coacervate ຂອງຊັ້ນເຂົ້າໄປໃນໂຄງສ້າງຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ລວມຕົວກັນຫຼາຍຂື້ນຫຼືຄ້າຍຄືແຂງເຮັດໃຫ້ການຕິດຕໍ່ໃກ້ຊິດລະຫວ່າງທາດໂປຼຕີນແລະ fluorescent probe ທີ່ຕິດກັບມັນ, ອາດຈະເຮັດໃຫ້ເກີດຜົນກະທົບທີ່ເຮັດໃຫ້ເກີດຄວາມວຸ່ນວາຍທີ່ສະແດງອອກໃນອາຍຸຂອງ probe ສັ້ນລົງ (τ) , ດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍກ່ອນຫນ້ານີ້ 40.,41 ,42.ນອກຈາກນັ້ນ, ສໍາລັບຕົວຢ່າງທີ່ມີປ້າຍສອງເທົ່າ (AF488 ແລະ Atto647N ເປັນ FRET ຜູ້ໃຫ້ທຶນແລະເຄື່ອງຍ້ອມສີທີ່ຍອມຮັບ, ຕາມລໍາດັບ), ການຫຼຸດລົງຂອງ τ ນີ້ຍັງສາມາດມາພ້ອມກັບຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງ coacervate ແລະການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງປະສິດທິພາບ FRET (E) ໃນລະຫວ່າງ LSPT.ພວກເຮົາໄດ້ຕິດຕາມການສ້າງຕັ້ງຂອງ raft ແລະຈຸດໃນໄລຍະເວລາໃນຕົວຢ່າງ LLPS αS/Tau441 ແລະ αS/ΔNt-Tau (25 µM ຂອງແຕ່ລະທາດໂປຼຕີນໃນ LLPS buffer ທີ່ມີ 1 µM AF488 ທີ່ຕິດສະຫຼາກ αS ແລະ/ຫຼື Atto647N ທີ່ຕິດສະຫຼາກ Tau441 ຫຼື ΔNt-Tau).ພວກເຮົາໄດ້ສັງເກດເຫັນທ່າອ່ຽງທົ່ວໄປໃນທີ່ຕະຫຼອດຊີວິດຂອງ fluorescence ຂອງ probes AF488 (τ488) ແລະ Atto647N (τ647N) ຫຼຸດລົງເລັກນ້ອຍຍ້ອນວ່າ coacervates ແກ່ແລ້ວ (ຮູບ 6 ແລະຮູບພາບເສີມ 8c).ຫນ້າສົນໃຈ, ການປ່ຽນແປງນີ້ໄດ້ຖືກປັບປຸງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍສໍາລັບຈຸດພາຍໃນ rafts (ຮູບ 6c), ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການຂົ້ນຂອງທາດໂປຼຕີນເພີ່ມເຕີມເກີດຂຶ້ນຢູ່ໃນຈຸດ.ໃນການສະຫນັບສະຫນູນນີ້, ບໍ່ມີການປ່ຽນແປງທີ່ສໍາຄັນຂອງ fluorescence ຕະຫຼອດຊີວິດໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນສໍາລັບ droplets αS / ΔNt-Tau ອາຍຸສໍາລັບ 24 h (ຕື່ມ Fig. 8d), ແນະນໍາວ່າ droplet gelation ແມ່ນຂະບວນການທີ່ແຕກຕ່າງຈາກຈຸດແລະບໍ່ໄດ້ມາພ້ອມກັບການປະຕິຮູບໂມເລກຸນທີ່ສໍາຄັນ. ພາຍໃນ coacervates.ມັນຄວນຈະສັງເກດວ່າຈຸດມີຂະຫນາດທີ່ແຕກຕ່າງກັນແລະເນື້ອໃນທີ່ປ່ຽນແປງໄດ້ໃນ αS, ໂດຍສະເພາະສໍາລັບລະບົບ αS/Tau441 (ຮູບເພີ່ມເຕີມ 8e).ການຫຼຸດລົງຂອງອາຍຸການ fluorescence ຈຸດແມ່ນມາພ້ອມກັບການເພີ່ມຂື້ນຂອງຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນ, ໂດຍສະເພາະສໍາລັບ Atto647N ທີ່ມີປ້າຍຊື່ Tau441 (ຕື່ມ Fig. 8a), ແລະປະສິດທິພາບ FRET ທີ່ສູງຂຶ້ນສໍາລັບທັງສອງລະບົບ αS / Tau441 ແລະ αS / ΔNt-Tau, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນຊົ່ວໂມງການ condensation ຕື່ມອີກໃນ LL. ຫຼັງ​ຈາກ​ການ​ກະ​ຕຸ້ນ​, ທາດ​ໂປຼ​ຕີນ​ທີ່​ຢູ່​ໃນ​ໄຟ​ຟ້າ​ສະ​ຖິດ​ທີ່​ຂົ້ນ​.ເມື່ອປຽບທຽບກັບ αS/ΔNt-Tau, ພວກເຮົາສັງເກດເຫັນຄ່າ τ647N ຕໍ່າກວ່າ ແລະຂ້ອນຂ້າງສູງກວ່າ τ488 ໃນຈຸດ αS/Tau441, ພ້ອມກັບຄ່າ FRET ທີ່ຕໍ່າກວ່າ ແລະບໍ່ມີມູນເຊື້ອຫຼາຍຂຶ້ນ.ເປັນໄປໄດ້, ນີ້ອາດຈະກ່ຽວຂ້ອງກັບຄວາມຈິງທີ່ວ່າໃນລະບົບ αS/Tau441, ຄວາມອຸດົມສົມບູນຂອງ αS ທີ່ສັງເກດເຫັນແລະຄາດວ່າຈະມີການລວມຕົວກັນຫຼາຍ, ມັກຈະ substoichiometric ເມື່ອທຽບກັບ Tau, ເນື່ອງຈາກວ່າ Tau441 ຕົວມັນເອງອາດຈະໄດ້ຮັບ LLPS ແລະການລວບລວມ (ຕື່ມ Fig. 8e). .ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ລະດັບຂອງການປະສົມຂອງ droplet, ການສ້າງ raft, ແລະ, ທີ່ສໍາຄັນ, ການລວບລວມທາດໂປຼຕີນພາຍໃນ coacervates ຄ້າຍຄືຂອງແຫຼວແມ່ນສູງສຸດໃນເວລາທີ່ທັງສອງ Tau441 ແລະαS.
ຮູບກ້ອງຈຸລະທັດ fluorescence (FLIM) ຕະຫຼອດຊີວິດຂອງ αS/Tau441 ແລະ αS/ΔNt-Tau ທີ່ 25 μM ຂອງແຕ່ລະທາດໂປຼຕີນ (1 μM AF488-ປ້າຍ αS ແລະ 1 μM Atto647N-ຕິດສະຫຼາກ Tau441 ຫຼື ΔNt-Taubuff) ໃນ LLPS.ຖັນສະແດງຮູບພາບຕົວແທນຂອງຕົວຢ່າງ LLPS ໃນຊ່ວງເວລາຂອງການເຕີບໃຫຍ່ທີ່ແຕກຕ່າງກັນ (30 ນາທີ, 5 ຊົ່ວໂມງ ແລະ 24 ຊົ່ວໂມງ).ຂອບສີແດງສະແດງໃຫ້ເຫັນພາກພື້ນທີ່ມີຈຸດ αS/Tau441.ໄລຍະເວລາຊີວິດແມ່ນສະແດງເປັນແຖບສີ.ແຖບຂະຫນາດ = 20 µm ສໍາລັບຮູບພາບທັງຫມົດ.b ຂະຫຍາຍຮູບ FLIM ຂອງພື້ນທີ່ທີ່ເລືອກ, ສະແດງຢູ່ໃນກ່ອງສີແດງໃນແຜງ a.ໄລຍະຊີວິດແມ່ນສະແດງໂດຍໃຊ້ຂະໜາດສີດຽວກັນກັບໃນແຜງ a.ແຖບຂະໜາດ = 5 µm.c ຮິສໂຕແກຣມທີ່ສະແດງ AF488 (ຕິດຢູ່ກັບ αS) ຫຼື Atto647N (ຕິດກັບ Tau) ສໍາລັບຊະນິດທາດໂປຼຕີນທີ່ແຕກຕ່າງກັນ (droplets-D-, raft-R- ແລະ speckle-P) ທີ່ລະບຸໄວ້ໃນຮູບ FLIM ທີ່ບັນທຶກໄວ້ສໍາລັບ αS-) ການແຈກຢາຍໄລຍະເວລາຕະຫຼອດຊີວິດຂອງ Tau441 ແລະ αS/ΔNt-Tau coacervate ຕົວຢ່າງ (N = 17-32 ROI ສໍາລັບ D, 29-44 ROI ສໍາລັບ R, ແລະ 21-51 ROI ສໍາລັບຈຸດ).ຄ່າສະເລ່ຍແລະຄ່າປານກາງແມ່ນສະແດງເປັນສີ່ຫຼ່ຽມສີເຫຼືອງແລະເສັ້ນສີດໍາພາຍໃນກ່ອງ, ຕາມລໍາດັບ.ຂອບເຂດຕ່ໍາແລະເທິງຂອງກ່ອງເປັນຕົວແທນຂອງ quartiles ທໍາອິດແລະທີສາມ, ຕາມລໍາດັບ, ແລະຄ່າຕ່ໍາສຸດແລະສູງສຸດພາຍໃນຂອບເຂດ interquartile 1.5-fold (IQR) ສະແດງໃຫ້ເຫັນເປັນ whiskers.Outliers ແມ່ນສະແດງເປັນເພັດສີດໍາ.ຄວາມສໍາຄັນທາງສະຖິຕິລະຫວ່າງຄູ່ຂອງການແຈກຢາຍໄດ້ຖືກກໍານົດໂດຍໃຊ້ການທົດສອບ t-ຕົວຢ່າງສອງຕົວຢ່າງ, ສົມມຸດວ່າຄວາມແຕກຕ່າງກັນບໍ່ເທົ່າທຽມກັນ.ການທົດສອບ p-values ​​ສອງຫາງແມ່ນສະແດງດ້ວຍຮູບດາວສໍາລັບແຕ່ລະຄູ່ຂອງຂໍ້ມູນປຽບທຽບ (* p-value > 0.01, ** p-value > 0.001, *** p-value > 0.0001, **** p-value > 0.00001), ns ຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງຄວາມລະເລີຍ (p-value > 0.05).ຄ່າ p ທີ່ແນ່ນອນແມ່ນໃຫ້ຢູ່ໃນຕາຕະລາງເສີມ 1, ແລະຂໍ້ມູນຕົ້ນສະບັບຖືກນໍາສະເຫນີເປັນໄຟລ໌ຂໍ້ມູນດິບ.
ເພື່ອສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງລັກສະນະຄ້າຍຄື amyloid ຂອງ speckles / ລວບລວມ, ພວກເຮົາໄດ້ປະຕິບັດຕົວຢ່າງ coacervate ທີ່ບໍ່ມີຮອຍແປ້ວເປັນເວລາ 24 ຊົ່ວໂມງດ້ວຍຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສູງຂອງ (1 M) NaCl, ເຊິ່ງເຮັດໃຫ້ການແຍກລວບລວມອອກຈາກທາດໂປຼຕິນ coacervates.ເມື່ອການສັງລວມທີ່ໂດດດ່ຽວ (ເຊັ່ນ: ການແກ້ໄຂການລວມຕົວທີ່ກະແຈກກະຈາຍ) ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນໂດຍໃຊ້ກ້ອງຈຸລະທັດຂອງຜົນບັງຄັບໃຊ້ປະລໍາມະນູ (AFM), ພວກເຮົາສັງເກດເຫັນຮູບຊົງກົມທີ່ມີລະດັບຄວາມສູງປົກກະຕິປະມານ 15 nm, ເຊິ່ງມີແນວໂນ້ມທີ່ຈະສົມທົບພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງເກືອສູງ, ຄ້າຍຄືກັບ ພຶດຕິກໍາຂອງເສັ້ນໄຍ amyloid ປົກກະຕິເນື່ອງຈາກຜົນກະທົບ hydrophobic ທີ່ເຂັ້ມແຂງຢູ່ດ້ານ (ສັງເກດວ່າ fibrils ປົກກະຕິແລ້ວມີຄວາມສູງຂອງ ~ 10 nm) (ຕື່ມ Fig. 10a).ຫນ້າສົນໃຈ, ໃນເວລາທີ່ການລວບລວມທີ່ໂດດດ່ຽວໄດ້ຖືກ incubated ກັບ ThT ໃນການທົດສອບ fluorescence ThT ມາດຕະຖານ, ພວກເຮົາໄດ້ສັງເກດເຫັນການເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຂອງຜົນຜະລິດ fluorescence quantum ThT, ເມື່ອທຽບກັບທີ່ສັງເກດເຫັນໃນເວລາທີ່ສີຍ້ອມໄດ້ຖືກ incubated ກັບ αS amyloid fibrils ປົກກະຕິ (ການແນະນໍາ 10b ເພີ່ມເຕີມ), ແນະນໍາວ່າ. ການລວບລວມ coacervate ມີໂຄງສ້າງຄ້າຍຄື amyloid..ໃນຄວາມເປັນຈິງ, ການລວບລວມແມ່ນມີຄວາມທົນທານຕໍ່ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງເກືອສູງແຕ່ມີຄວາມອ່ອນໄຫວຕໍ່ກັບ 4 M guanidine chloride (GdnHCl), ຄືກັບເສັ້ນໃຍ amyloid ປົກກະຕິ (ຮູບພາບເສີມ 10c).
ຕໍ່ໄປ, ພວກເຮົາໄດ້ວິເຄາະອົງປະກອບຂອງການລວມກັນໂດຍໃຊ້ fluorescence ໂມເລກຸນດຽວ, ສະເພາະ fluorescence correlation/cross-correlation spectroscopy (FCS/FCCS), ແລະການວິເຄາະລະເບີດຂອງການກວດຫາຄວາມບັງເອີນສອງສີ (TCCD).ເພື່ອເຮັດສິ່ງນີ້, ພວກເຮົາແຍກຕົວລວມທີ່ສ້າງຂຶ້ນຫຼັງຈາກ 24 ຊົ່ວໂມງຂອງການຟອກຢູ່ໃນ 100 μl LLPS ຕົວຢ່າງທີ່ມີ αS ແລະ Tau441 (ທັງສອງ 25 μM) ຮ່ວມກັບ 1 μM AF488-ຕິດສະຫຼາກ αS ແລະ 1 μM Atto647N-ຕິດສະຫຼາກ Tau441.ເຈືອຈາງການແກ້ໄຂການລວມຕົວທີ່ກະແຈກກະຈາຍທີ່ເປັນຜົນມາຈາກລັດ monomolecular ໂດຍໃຊ້ buffer ທີ່ບໍ່ມີ PEG ດຽວກັນແລະ 1 M NaCl (buffer ດຽວກັນທີ່ໃຊ້ເພື່ອແຍກການລວມອອກຈາກ coacervate) ເພື່ອປ້ອງກັນປະຕິສໍາພັນ electrostatic ທີ່ເປັນໄປໄດ້ລະຫວ່າງ LLPS ແລະທາດໂປຼຕີນ.ຕົວຢ່າງຂອງ trajectory ເວລາຂອງໂມເລກຸນດຽວສາມາດເຫັນໄດ້ໃນຮູບ 7a.ການວິເຄາະ FCCS/FCS (ການເຊື່ອມໂຍງຂ້າມ, CC ແລະ autocorrelation, AC) ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການລວບລວມທີ່ມີ αS ແລະ tau ແມ່ນອຸດົມສົມບູນໃນຕົວຢ່າງ (ເບິ່ງເສັ້ນໂຄ້ງ CC ໃນຮູບ 7b, ແຜງດ້ານຊ້າຍ), ແລະສ່ວນເກີນຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ monomeric ທີ່ຕົກຄ້າງເກີດຂຶ້ນເປັນ ຜົນຂອງຂະບວນການເຈືອຈາງ (ເບິ່ງເສັ້ນໂຄ້ງ AC ໃນຮູບ 7b, ແຜງດ້ານຊ້າຍ).ການທົດລອງຄວບຄຸມທີ່ດໍາເນີນພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂການແກ້ໄຂດຽວກັນໂດຍໃຊ້ຕົວຢ່າງທີ່ມີພຽງແຕ່ທາດໂປຼຕີນ monomeric ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າບໍ່ມີເສັ້ນໂຄ້ງ CC, ແລະເສັ້ນໂຄ້ງ AC ເຫມາະກັບຮູບແບບການແຜ່ກະຈາຍຂອງອົງປະກອບດຽວ (Eq. 4), ບ່ອນທີ່ໂປຣຕີນ monomeric ມີຄ່າສໍາປະສິດການແຜ່ກະຈາຍທີ່ຄາດໄວ້ (ຮູບ 7b. ), ກະດານຂວາ).ຄ່າສໍາປະສິດການແຜ່ກະຈາຍຂອງອະນຸພາກລວມແມ່ນຫນ້ອຍກວ່າ 1 µm2/s, ແລະທາດໂປຼຕີນຈາກ monomeric ແມ່ນປະມານ 1 µm2/s.50–100 µm/s;ຄ່າແມ່ນຄ້າຍຄືກັນກັບຄ່າທີ່ຈັດພີມມາກ່ອນຫນ້ານີ້ສໍາລັບ sonicated αS amyloid fibrils ແລະ monomeric αS ແຍກຕ່າງຫາກພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂການແກ້ໄຂທີ່ຄ້າຍຄືກັນ44.ເມື່ອພວກເຮົາວິເຄາະການລວບລວມດ້ວຍການວິເຄາະການລະເບີດຂອງ TCCD (ຮູບ 7c, ກະດານເທິງ), ພວກເຮົາພົບວ່າໃນແຕ່ລະການລວບລວມທີ່ໂດດດ່ຽວ (αS / Tau heteroaggregate), ປະມານ 60% ຂອງລວບລວມທີ່ກວດພົບມີທັງ αS ແລະ tau, ປະມານ 30% ມີພຽງແຕ່ tau, ປະມານ 10% αS ເທົ່ານັ້ນ.ການວິເຄາະ Stoichiometric ຂອງ αS/Tau heteroaggregates ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າສ່ວນໃຫຍ່ຂອງ heteroaggregates ແມ່ນອຸດົມສົມບູນໃນ tau (stoichiometry ຕ່ໍາກວ່າ 0.5, ຈໍານວນໂມເລກຸນ tau ສະເລ່ຍຕໍ່ລວມແມ່ນ 4 ເທົ່າຂອງໂມເລກຸນ αS), ເຊິ່ງສອດຄ່ອງກັບວຽກງານຂອງພວກເຮົາທີ່ສັງເກດເຫັນໃນ FLIM ຢູ່ໃນສະຖານທີ່. ການທົດລອງ..ການວິເຄາະ FRET ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການລວບລວມເຫຼົ່ານີ້ມີທາດໂປຼຕີນທັງສອງ, ເຖິງແມ່ນວ່າຄ່າ FRET ຕົວຈິງໃນກໍລະນີນີ້ບໍ່ມີຄວາມສໍາຄັນຫຼາຍ, ນັບຕັ້ງແຕ່ການແຈກຢາຍ fluorophores ໃນແຕ່ລະລວບລວມແມ່ນແບບສຸ່ມຍ້ອນການເກີນຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ບໍ່ມີປ້າຍຊື່ທີ່ໃຊ້ໃນການທົດລອງ.ຫນ້າສົນໃຈ, ໃນເວລາທີ່ພວກເຮົາປະຕິບັດການວິເຄາະດຽວກັນໂດຍໃຊ້ຕົວແປ Tau ຂາດການລວບລວມ amyloid 45,46 mature (ເບິ່ງເພີ່ມເຕີມ Fig. 11a,b), ພວກເຮົາສັງເກດເຫັນວ່າເຖິງແມ່ນວ່າການລວບລວມ electrostatic αS ແມ່ນຄືກັນ (ຕື່ມ Fig. 11c, d), ຄວາມສາມາດໃນການປະກອບການລວບລວມພາຍໃນ coacervate ແມ່ນຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍແລະ FLIM ກວດພົບຈຸດຫຼາຍຈຸດໃນການທົດລອງສະຖານທີ່, ແລະເສັ້ນໂຄ້ງຂອງຄວາມກ່ຽວຂ້ອງທີ່ອ່ອນແອໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນສໍາລັບຕົວຢ່າງລວມທີ່ໂດດດ່ຽວ.ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ສໍາລັບຈໍານວນການລວບລວມທີ່ກວດພົບຈໍານວນຫນ້ອຍ (ພຽງແຕ່ຫນຶ່ງສ່ວນສິບຂອງ Tau441), ພວກເຮົາສັງເກດເຫັນວ່າການລວບລວມແຕ່ລະແມ່ນອຸດົມສົມບູນໃນ αS ຫຼາຍກວ່າຕົວແປ Tau ນີ້, ປະມານ 50% ຂອງຈໍານວນລວບລວມທີ່ກວດພົບມີພຽງແຕ່ໂມເລກຸນ αS, ແລະ αS ມີຄວາມແຕກຕ່າງກັນຫຼາຍ. .aggregates (ເບິ່ງເພີ່ມເຕີມ Fig. 11e), ກົງກັນຂ້າມກັບການລວບລວມ heterogeneous ທີ່ສ້າງຂຶ້ນໂດຍ Tau441 (ຮູບ 6f).ຜົນໄດ້ຮັບຂອງການທົດລອງເຫຼົ່ານີ້ໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ αS ຕົວຂອງມັນເອງສາມາດສະສົມກັບ tau ພາຍໃນ coacervate, ການ nucleation tau ແມ່ນເອື້ອອໍານວຍຫຼາຍພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂເຫຼົ່ານີ້, ແລະການລວບລວມຂໍ້ມູນຄ້າຍຄື amyloid ສາມາດປະຕິບັດເປັນຮູບແບບຂອງ αS ແລະ tau.ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ເມື່ອເປັນຫຼັກທີ່ອຸດົມສົມບູນໄດ້ສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນ, ປະຕິສໍາພັນ heterotypic ລະຫວ່າງ αS ແລະ tau ໄດ້ຮັບການເອື້ອອໍານວຍໃນການລວມຕົວກັນໃນໄລຍະປະຕິສໍາພັນ homotypic ລະຫວ່າງໂມເລກຸນ tau;ພວກເຮົາຍັງສັງເກດເຫັນເຄືອຂ່າຍທາດໂປຼຕີນໃນຂອງແຫຼວ αS/tau coacervates.
ຮ່ອງຮອຍທາງຊົ່ວຄາວ fluorescence ຕົວແທນຂອງໂມເລກຸນດຽວຂອງສັງລວມທີ່ໂດດດ່ຽວສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນໃນ αS/Tau441 coacervates electrostatic.ການລະເບີດທີ່ສອດຄ້ອງກັບ αS/Tau441 coaggregates (bursts ຂ້າງເທິງຂອບເຂດທີ່ລະບຸ) ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນໃນສາມຊ່ອງທາງການກວດພົບ (ການປ່ອຍອາຍພິດ AF488 ແລະ Atto647N ຫຼັງຈາກຄວາມຕື່ນເຕັ້ນໂດຍກົງ, ເສັ້ນສີຟ້າແລະສີແດງ, ການປ່ອຍອາຍພິດ Atto647N ຫຼັງຈາກຄວາມຕື່ນເຕັ້ນທາງອ້ອມ), FRET, ເສັ້ນສີມ່ວງ).b ການວິເຄາະ FCS/FCCS ຂອງຕົວຢ່າງຂອງ αS/Tau441 ທີ່ໂດດດ່ຽວທີ່ໄດ້ມາຈາກ LLPS (ກະດານຊ້າຍ).ເສັ້ນໂຄ້ງ Autocorrelation (AC) ສໍາລັບ AF488 ແລະ Atto647N ແມ່ນສະແດງເປັນສີຟ້າ ແລະສີແດງ, ຕາມລໍາດັບ, ແລະເສັ້ນໂຄ້ງ cross-correlation (CC) ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການລວບລວມທີ່ມີສີຍ້ອມທັງສອງແມ່ນສະແດງໃຫ້ເຫັນເປັນສີມ່ວງ.ເສັ້ນໂຄ້ງ AC ສະທ້ອນໃຫ້ເຫັນເຖິງການມີສະຫຼາກຂອງຊະນິດທາດໂປຼຕີນຈາກ monomeric ແລະລວບລວມ, ໃນຂະນະທີ່ເສັ້ນໂຄ້ງ CC ສະແດງໃຫ້ເຫັນພຽງແຕ່ການແຜ່ກະຈາຍຂອງສອງປ້າຍລວມ.ການວິເຄາະດຽວກັນ, ແຕ່ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂການແກ້ໄຂດຽວກັນກັບຈຸດທີ່ໂດດດ່ຽວ, ຕົວຢ່າງທີ່ມີພຽງແຕ່ monomeric αS ແລະ Tau441 ສະແດງໃຫ້ເຫັນເປັນການຄວບຄຸມໃນກະດານທີ່ຖືກຕ້ອງ.c ການວິເຄາະແຟລວອໍເຣສເຊນຂອງໂມເລກຸນດຽວຂອງສັງລວມທີ່ໂດດດ່ຽວທີ່ສ້າງຂຶ້ນໃນ αS/Tau441 coacervates electrostatic.ຂໍ້ມູນສໍາລັບແຕ່ລະອັນທີ່ພົບເຫັນຢູ່ໃນສີ່ຊ້ໍາກັນ (N = 152) ຖືກວາງແຜນຕໍ່ກັບ stoichiometry, ຄ່າ S, ແລະປະສິດທິພາບ FRET ຂອງພວກເຂົາ (ກະດານເທິງ, ແຖບສີສະທ້ອນໃຫ້ເຫັນເຖິງການປະກົດຕົວ).ສາມາດຈຳແນກໄດ້ສາມປະເພດ: -αS-ລວມພຽງແຕ່ S~1 ແລະ FRET~0, ລວມພຽງແຕ່ Tau ກັບ S~0 ແລະ FRET~1, ແລະການລວມຕົວຂອງ Tau/αS heterogeneous ກັບລະດັບປານກາງ S ແລະ FRET ການຄາດຄະເນຂອງປະລິມານ. ຂອງທັງສອງທາດໂປຼຕີນຈາກເຄື່ອງຫມາຍທີ່ກວດພົບໃນແຕ່ລະການລວບລວມ heterogeneous (N = 100) ແມ່ນສະແດງຢູ່ໃນກະດານຕ່ໍາ (ຂະຫນາດສີສະທ້ອນໃຫ້ເຫັນເຖິງການປະກົດຕົວ).ຂໍ້ມູນດິບແມ່ນສະຫນອງໃຫ້ໃນຮູບແບບຂອງໄຟລ໌ຂໍ້ມູນດິບ.
ການແກ່ຕົວຫຼືຄວາມແກ່ຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກແຫຼວ condensates ເຂົ້າໄປໃນໂຄງສ້າງຄ້າຍຄື gel ຫຼືແຂງໃນໄລຍະເວລາໄດ້ຖືກລາຍງານວ່າມີສ່ວນກ່ຽວຂ້ອງກັບການເຮັດວຽກທາງຊີວະວິທະຍາຂອງ condensate47 ເຊັ່ນດຽວກັນກັບພະຍາດ, ເປັນຂະບວນການຜິດປົກກະຕິກ່ອນການລວບລວມ amyloid 7, 48, 49. ພວກ​ເຮົາ​ສຶກ​ສາ​ການ​ແຍກ​ຂັ້ນ​ຕອນ​ແລະ​ພຶດ​ຕິ​ກໍາ​ໂດຍ​ລະ​ອຽດ​.LSPT αS ໃນທີ່ປະທັບຂອງ polycations ແບບສຸ່ມໃນສະພາບແວດລ້ອມທີ່ມີການຄວບຄຸມທີ່ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ micromolar ຕ່ໍາແລະເງື່ອນໄຂທີ່ກ່ຽວຂ້ອງທາງດ້ານ physiological (ສັງເກດວ່າຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນທາງຊີວະວິທະຍາທີ່ຄິດໄລ່ຂອງ αS ແມ່ນ>1 µM50), ປະຕິບັດຕາມພຶດຕິກໍາການຂັບເຄື່ອນທາງອຸນຫະພູມປົກກະຕິຂອງ LPS.ພວກເຮົາພົບວ່າ αS, ເຊິ່ງປະກອບດ້ວຍພາກພື້ນ C-terminal ທີ່ມີຄ່າທາງລົບສູງຢູ່ທີ່ pH ທາງດ້ານສະລີລະວິທະຍາ, ສາມາດສ້າງເປັນ droplets ທີ່ມີທາດໂປຼຕີນໃນການແກ້ໄຂນ້ໍາຜ່ານ LLPS ໃນທີ່ປະທັບຂອງ peptides ທີ່ຜິດປົກກະຕິ cationic ສູງເຊັ່ນ pLK ຫຼື Tau ຜ່ານຂະບວນການຂອງ electrostatic. condensation ສະລັບສັບຊ້ອນໃນທີ່ປະທັບຂອງ macromolecules ລວບລວມ.ຂະບວນການນີ້ອາດຈະມີຜົນກະທົບທີ່ກ່ຽວຂ້ອງໃນສະພາບແວດລ້ອມຂອງເຊນທີ່ αS ພົບກັບໂມເລກຸນ polycationic ຕ່າງໆທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການລວມຕົວຂອງພະຍາດຂອງມັນທັງໃນ vitro ແລະໃນ vivo51,52,53,54.
ໃນການສຶກສາຈໍານວນຫຼາຍ, ນະໂຍບາຍດ້ານທາດໂປຼຕີນພາຍໃນ droplets ໄດ້ຖືກພິຈາລະນາເປັນຫນຶ່ງໃນປັດໃຈສໍາຄັນທີ່ກໍານົດຂະບວນການໃຫຍ່ເຕັມຕົວ55,56.ໃນ electrostatic αS coacervates ກັບ polycations, ຂະບວນການໃຫຍ່ທີ່ປາກົດຂື້ນແມ່ນຂຶ້ນກັບຄວາມເຂັ້ມແຂງຂອງປະຕິສໍາພັນກັບ polycations, valence, ແລະ multiplicity ຂອງການໂຕ້ຕອບເຫຼົ່ານີ້.ທິດສະດີຄວາມສົມດູນຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າພູມສັນຖານສົມດຸນຂອງສອງລັດຂອງແຫຼວຈະເປັນຂອງ droplet ຂະຫນາດໃຫຍ່ທີ່ອຸດົມສົມບູນໃນ biopolymer ທີ່ຂັບ LLPS57,58.ການຂະຫຍາຍຕົວຂອງ droplet ສາມາດບັນລຸໄດ້ໂດຍການເຕີບໃຫຍ່ຂອງ Ostwald59, coalescence60 ຫຼືການບໍລິໂພກ monomer ຟຣີໃນໄລຍະທີ່ກະແຈກກະຈາຍ 61.ສໍາລັບ αS ແລະ Tau441, ΔNt-Tau ຫຼື pLK, ສ່ວນໃຫຍ່ຂອງທາດໂປຼຕີນແມ່ນເຂັ້ມຂຸ້ນຢູ່ໃນ condensate ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂທີ່ໃຊ້ໃນການສຶກສານີ້.ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ໃນຂະນະທີ່ droplets tau ຂະຫນາດເຕັມ coalesced ຢ່າງໄວວາຕາມຄວາມຊຸ່ມຂອງພື້ນຜິວ, droplet coalescence ແລະການ wetting ແມ່ນມີຄວາມຫຍຸ້ງຍາກສໍາລັບ ΔNt-Tau ແລະ pLK, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງການສູນເສຍຢ່າງໄວວາຂອງທາດແຫຼວໃນສອງລະບົບນີ້.ອີງຕາມການວິເຄາະ FLIM-FRET ຂອງພວກເຮົາ, ຢອດ pLK ແລະ ΔNt-Tau ອາຍຸໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນລະດັບທີ່ຄ້າຍຄືກັນຂອງການລວບລວມທາດໂປຼຕີນ (ອາຍຸການ fluorescence ທີ່ຄ້າຍຄືກັນ) ເປັນ droplets ຕົ້ນສະບັບ, ແນະນໍາວ່າເຄືອຂ່າຍທາດໂປຼຕີນຈາກຕົ້ນສະບັບໄດ້ຖືກເກັບຮັກສາໄວ້, ເຖິງແມ່ນວ່າຈະເຄັ່ງຄັດຫຼາຍ.
ພວກເຮົາສົມເຫດສົມຜົນຜົນໄດ້ຮັບການທົດລອງຂອງພວກເຮົາໃນຮູບແບບດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້ (ຮູບ 8).droplets ສ້າງຕັ້ງຂື້ນໃນເບື້ອງຕົ້ນຊົ່ວຄາວມັກຈະເປັນເຄືອຂ່າຍທາດໂປຼຕີນໂດຍບໍ່ມີການຊົດເຊີຍ electrostatic, ແລະດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງມີພື້ນທີ່ຂອງ imbalance ຮັບຜິດຊອບ, ໂດຍສະເພາະໃນການໂຕ້ຕອບ droplet, ສົ່ງຜົນໃຫ້ droplets ມີທ່າແຮງດ້ານ electrostatic ສູງ.ເພື່ອຊົດເຊີຍຄ່າໃຊ້ຈ່າຍ (ປະກົດການທົ່ວໄປເອີ້ນວ່າ valence depletion) ແລະຫຼຸດຜ່ອນທ່າແຮງດ້ານຫນ້າຂອງ droplets, droplets ສາມາດປະກອບມີ polypeptides ໃຫມ່ຈາກໄລຍະເຈືອຈາງ, ຈັດລະບຽບເຄືອຂ່າຍທາດໂປຼຕີນໃຫມ່ເພື່ອເພີ່ມປະສິດທິພາບການໂຕ້ຕອບຂອງ charge-charge, ແລະພົວພັນກັບ droplets ອື່ນໆ.ມີຫນ້າດິນ (wetting).αS/pLK droplets, ເນື່ອງຈາກເຄືອຂ່າຍທາດໂປຼຕີນທີ່ງ່າຍດາຍຂອງພວກມັນ (ພຽງແຕ່ປະຕິສໍາພັນ heterotypic ລະຫວ່າງ αS ແລະ pLK) ແລະຄວາມໃກ້ຊິດຫຼາຍກວ່າເກົ່າສໍາລັບປະຕິສໍາພັນຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກທາດໂປຼຕີນ, ເບິ່ງຄືວ່າຈະສາມາດດຸ່ນດ່ຽງການຮັບຜິດຊອບຂອງ condensate ໄດ້ໄວຂຶ້ນ;ແທ້ຈິງແລ້ວ, ພວກເຮົາສັງເກດເຫັນ kinetics ທາດໂປຼຕີນທີ່ໄວຂຶ້ນໃນ αS/pLK coacervates ໃນເບື້ອງຕົ້ນກ່ວາ αS/Tau.ຫຼັງຈາກການຫຼຸດລົງຂອງ valence, ປະຕິສໍາພັນຈະກາຍເປັນ ephemeral ຫນ້ອຍແລະ droplets ສູນເສຍຄຸນສົມບັດຂອງແຫຼວຂອງເຂົາເຈົ້າແລະປ່ຽນເປັນ droplets ຄ້າຍຄື gel, ບໍ່ຕິດໄຟທີ່ມີທ່າແຮງດ້ານ electrostatic ຕ່ໍາ (ແລະດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງບໍ່ສາມາດທີ່ຈະປຽກຫນ້າດິນ).ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, αS/Tau droplets ມີປະສິດທິພາບຫນ້ອຍໃນການເພີ່ມປະສິດທິພາບການດຸ່ນດ່ຽງຂອງຄ່າ droplet ເນື່ອງຈາກເຄືອຂ່າຍທາດໂປຼຕີນທີ່ສັບສົນຫຼາຍ (ມີປະຕິສໍາພັນຂອງ homotypic ແລະ heterotypic) ແລະລັກສະນະທີ່ອ່ອນແອຂອງປະຕິສໍາພັນຂອງທາດໂປຼຕີນ.ອັນນີ້ສົ່ງຜົນໃຫ້ຢອດທີ່ຮັກສາພຶດຕິກຳຂອງແຫຼວເປັນໄລຍະເວລາ ແລະ ສະແດງໃຫ້ເຫັນທ່າແຮງດ້ານໄຟຟ້າສະຖິດສູງທີ່ມັກຈະຖືກຫຼຸດໜ້ອຍລົງໂດຍການເຊື່ອມຕົວ ແລະ ການຂະຫຍາຍຕົວ (ດັ່ງນັ້ນການຫຼຸດພື້ນທີ່/ປະລິມານຂອງຢອດ) ແລະໂດຍການປຽກສານເຄມີພື້ນຜິວ hydrophilic.ນີ້ສ້າງຫ້ອງສະຫມຸດທາດໂປຼຕີນທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂະຫນາດໃຫຍ່ທີ່ຮັກສາຄຸນສົມບັດຂອງນ້ໍາຍ້ອນວ່າປະຕິສໍາພັນຍັງຄົງຢູ່ຫຼາຍຊົ່ວຄາວເນື່ອງຈາກການຄົ້ນຫາຄົງທີ່ສໍາລັບການເພີ່ມປະສິດທິພາບຄ່າໃຊ້ຈ່າຍໃນເຄືອຂ່າຍທາດໂປຼຕີນ.ຫນ້າສົນໃຈ, N-terminally truncated forms of Tau, ລວມທັງບາງ isoforms62 ທີ່ເກີດຂຶ້ນຕາມທໍາມະຊາດ, ສະແດງໃຫ້ເຫັນພຶດຕິກໍາລະດັບປານກາງ, ມີ coacervates aging ກັບ αS ເຂົ້າໄປໃນ droplets ຍາວຄ້າຍຄື gel, ໃນຂະນະທີ່ບາງຊະນິດປ່ຽນເປັນ condensates ແຫຼວຂະຫນາດໃຫຍ່.duality ນີ້ໃນການເຕີບໃຫຍ່ຂອງ αS electrostatic coacervates ແມ່ນສອດຄ່ອງກັບການສຶກສາທິດສະດີແລະການທົດລອງຂອງ LLPS ທີ່ຜ່ານມາທີ່ໄດ້ກໍານົດຄວາມສໍາພັນລະຫວ່າງ valence depletion ແລະການ sieving electrostatic ໃນ condensates ເປັນກຸນແຈສໍາລັບການຄວບຄຸມຂະຫນາດຂອງ condensate ແລະຄຸນສົມບັດຂອງນ້ໍາ.ກົນໄກ 58.61.
ໂຄງການນີ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນເສັ້ນທາງການລວບລວມ amyloid putative ສໍາລັບ αS ແລະ Tau441 ຜ່ານ LLPS ແລະ LSPT.ດ້ວຍພາກພື້ນທີ່ອຸດົມສົມບູນ anion (ສີແດງ) ແລະ cation-rich (ສີຟ້າ), αS ແລະ tau electrostatic coacervates ທີ່ມີ valence ທີ່ຫນ້າພໍໃຈມີພະລັງງານດ້ານຕ່ໍາແລະດັ່ງນັ້ນການ coalescence ຫນ້ອຍ, ສົ່ງຜົນໃຫ້ droplet aging ໄວ.ສະຖານະ gel ທີ່ບໍ່ລວມຕົວຄົງທີ່ແມ່ນບັນລຸໄດ້..ສະຖານະການນີ້ແມ່ນເອື້ອອໍານວຍຫຼາຍໃນກໍລະນີຂອງລະບົບ αS/pLK ເນື່ອງຈາກຄວາມໃກ້ຊິດທີ່ສູງຂຶ້ນແລະເຄືອຂ່າຍປະຕິສໍາພັນຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ງ່າຍດາຍ, ເຊິ່ງອະນຸຍາດໃຫ້ມີການຫັນປ່ຽນໄວຄ້າຍຄື gel.ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ຢອດທີ່ມີ valence ທີ່ບໍ່ຫນ້າພໍໃຈແລະ, ດັ່ງນັ້ນ, ພາກພື້ນທີ່ມີທາດໂປຼຕີນທີ່ມີປະຕິສໍາພັນ, ເຮັດໃຫ້ມັນງ່າຍຂຶ້ນສໍາລັບ coacervate ທີ່ຈະ fuse ແລະຊຸ່ມຫນ້າດິນ hydrophilic ເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນພະລັງງານສູງຂອງມັນ.ສະຖານະການນີ້ແມ່ນດີກວ່າສໍາລັບ αS/Tau441 coacervates, ທີ່ມີເຄືອຂ່າຍສະລັບສັບຊ້ອນຫຼາຍອັນປະກອບດ້ວຍປະຕິສໍາພັນ Tau-Tau ແລະ αS-Tau ທີ່ອ່ອນແອ.ໃນທາງກັບກັນ, coacervates ທີ່ໃຫຍ່ກວ່າຈະຮັກສາຄຸນສົມບັດຄ້າຍຄືນ້ໍາຂອງພວກມັນ, ອະນຸຍາດໃຫ້ປະຕິສໍາພັນຂອງທາດໂປຼຕີນກັບທາດໂປຼຕີນອື່ນໆເກີດຂຶ້ນ.ໃນທີ່ສຸດ, amyloid heterogeneous aggregates ທີ່ມີທັງ αS ແລະ tau ປະກອບຢູ່ໃນນ້ໍາ coacervate, ເຊິ່ງອາດຈະກ່ຽວຂ້ອງກັບສິ່ງທີ່ພົບເຫັນຢູ່ໃນຮ່າງກາຍລວມ, ເຊິ່ງເປັນຈຸດເດັ່ນຂອງພະຍາດ neurodegenerative.
ໂຄງສ້າງຄ້າຍຄືນ້ໍາຂະຫນາດໃຫຍ່ສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນໃນລະຫວ່າງການຈະເລີນເຕີບໂຕຂອງ αS / Tau441 ທີ່ມີສະພາບແວດລ້ອມທາດໂປຼຕີນທີ່ congested ສູງແຕ່ແບບເຄື່ອນໄຫວແລະ, ໃນຂອບເຂດຫນ້ອຍ, αS / ΔNt-Tau coacervates ແມ່ນອ່າງເກັບນ້ໍາທີ່ເຫມາະສົມສໍາລັບການ nucleation ຂອງການລວບລວມທາດໂປຼຕີນ.ພວກ​ເຮົາ​ໄດ້​ສັງ​ເກດ​ຢ່າງ​ແທ້​ຈິງ​ການ​ສ້າງ​ຕັ້ງ​ຂອງ​ການ​ລວມ​ຕົວ​ຂອງ​ທາດ​ໂປຼ​ຕີນ​ທີ່​ແຂງ​ໃນ​ປະ​ເພດ​ຂອງ coacervates ໂປຣ​ຕີນ​ນີ້​, ມັກ​ຈະ​ມີ​ທັງ αS ແລະ tau​.ພວກເຮົາໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ heteroaggregates ເຫຼົ່ານີ້ມີຄວາມຫມັ້ນຄົງໂດຍການປະຕິສໍາພັນທີ່ບໍ່ແມ່ນໄຟຟ້າສະຖິດ, ສາມາດຜູກມັດສີຍ້ອມ ThT ສະເພາະ amyloid ໃນລັກສະນະດຽວກັນກັບເສັ້ນໄຍ amyloid ປົກກະຕິ, ແລະແທ້ຈິງແລ້ວມີຄວາມຕ້ານທານທີ່ຄ້າຍຄືກັນກັບອິດທິພົນຕ່າງໆ.αS/tau ລວມທີ່ສ້າງຂຶ້ນໂດຍ LLPS ໄດ້ຖືກສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າມີຄຸນສົມບັດຄ້າຍຄື amyloid.ແທ້ຈິງແລ້ວ, ການປ່ຽນແປງທີ່ແກ່ແລ້ວຂອງ Tau ຂາດການລວບລວມ amyloid ແມ່ນມີຄວາມບົກຜ່ອງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນການສ້າງການລວບລວມαS heterogeneous ເຫຼົ່ານີ້ພາຍໃນຂອງແຫຼວ electrostatic coacervate.ການສ້າງຕັ້ງຂອງ αS/Tau441 ລວບລວມໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນພຽງແຕ່ພາຍໃນ coacervates, ເຊິ່ງຮັກສາຄຸນສົມບັດຄ້າຍຄືຂອງແຫຼວ, ແລະບໍ່ເຄີຍ, ຖ້າ coacervates / droplets ບໍ່ຮອດສະຖານະ gel.ໃນກໍລະນີສຸດທ້າຍ, ຄວາມເຂັ້ມແຂງທີ່ເພີ່ມຂຶ້ນຂອງປະຕິສໍາພັນ electrostatic ແລະ, ດັ່ງນັ້ນ, ຄວາມເຂັ້ມງວດຂອງເຄືອຂ່າຍທາດໂປຼຕີນປ້ອງກັນການປັບໂຄງສ້າງຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ມີຄວາມຈໍາເປັນເພື່ອສ້າງປະຕິສໍາພັນທາດໂປຼຕີນໃຫມ່ທີ່ຈໍາເປັນສໍາລັບການ nucleation amyloid.ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ນີ້ສາມາດບັນລຸໄດ້ໃນຄວາມຍືດຫຍຸ່ນ, ຄ້າຍຄືຂອງແຫຼວ coacervates, ຊຶ່ງໃນນັ້ນມີແນວໂນ້ມທີ່ຈະຍັງຄົງເປັນຂອງແຫຼວຍ້ອນວ່າເຂົາເຈົ້າເພີ່ມຂຶ້ນໃນຂະຫນາດ.
ຄວາມຈິງທີ່ວ່າການສ້າງຕັ້ງຂອງລວບລວມພາຍໃນໄລຍະ condensate ແມ່ນມັກໃນຂະຫນາດໃຫຍ່ αS / Tau condensates ກ່ວາໃນ droplets ຂະຫນາດນ້ອຍທີ່ gel ຢ່າງໄວວາ, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງຄວາມກ່ຽວຂ້ອງຂອງການກໍານົດປັດໃຈທີ່ຄວບຄຸມການຮ່ວມຂອງ droplet ໄດ້.ດັ່ງນັ້ນ, ບໍ່ພຽງແຕ່ມີແນວໂນ້ມສໍາລັບການແຍກໄລຍະ, ແຕ່ຂະຫນາດຂອງ condensate ຕ້ອງໄດ້ຮັບການຄວບຄຸມສໍາລັບການເຮັດວຽກທີ່ເຫມາະສົມເຊັ່ນດຽວກັນກັບການປ້ອງກັນພະຍາດ58,61.ຜົນໄດ້ຮັບຂອງພວກເຮົາຍັງຊີ້ໃຫ້ເຫັນຄວາມສໍາຄັນຂອງການດຸ່ນດ່ຽງລະຫວ່າງ LLPS ແລະ LSPT ສໍາລັບລະບົບαS/Tau.ໃນຂະນະທີ່ການສ້າງ droplet ອາດຈະປ້ອງກັນການລວມຕົວຂອງ amyloid ໂດຍການຫຼຸດຜ່ອນປະລິມານຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ monomers ທີ່ມີຢູ່ໃນເງື່ອນໄຂການອີ່ມຕົວ, ດັ່ງທີ່ໄດ້ສະເຫນີໃນລະບົບອື່ນໆ 63,64, droplet fusion ໃນລະດັບ droplet ສູງອາດຈະນໍາໄປສູ່ການລວບລວມທາດໂປຼຕີນຈາກພາຍໃນໂດຍຜ່ານການຈັດລຽງແບບຊ້າໆ.ເຄືອຂ່າຍທາດໂປຼຕີນ..
ໂດຍລວມແລ້ວ, ຂໍ້ມູນຂອງພວກເຮົາເນັ້ນຫນັກຢ່າງຫນັກແຫນ້ນເຖິງຄວາມກ່ຽວຂ້ອງຂອງ valence ທີ່ສອດຄ່ອງແລະການພົວພັນກັບຄວາມພໍໃຈ / ຄວາມບໍ່ພໍໃຈໃນເຄືອຂ່າຍຫຼຸດລົງໃນສະພາບການຂອງ LSPT.ໂດຍສະເພາະ, ພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ αS/Tau441 condensates ທີ່ມີຄວາມຍາວເຕັມສາມາດ fuse ແລະ nucleate ເພື່ອສ້າງເປັນ heteroaggregates ຄ້າຍຄື amyloid ທີ່ປະກອບມີທັງທາດໂປຼຕີນແລະສະເຫນີກົນໄກໂມເລກຸນໂດຍອີງໃສ່ຜົນການທົດລອງຂອງພວກເຮົາ.ການລວມຕົວຂອງທາດໂປຼຕີນສອງອັນໃນ αS/Tau fluid coacervate ທີ່ພວກເຮົາລາຍງານຢູ່ທີ່ນີ້ແນ່ນອນອາດຈະກ່ຽວຂ້ອງກັບການລວມຕົວຂອງສອງທາດໂປຼຕີນໃນການປະສົມປະສານ, ເຊິ່ງເປັນຈຸດເດັ່ນຂອງພະຍາດ, ແລະອາດຈະປະກອບສ່ວນເຂົ້າໃນຄວາມເຂົ້າໃຈຄວາມສໍາພັນລະຫວ່າງ LLPS ແລະ. ການລວບລວມ amyloid, ປູທາງສໍາລັບ IDP ທີ່ຄິດຄ່າສູງໃນ neurodegeneration.
Monomeric WT-αS, cysteine ​​mutants (Q24C-αS, N122C-αS) ແລະ ΔCt-αS variants (Δ101-140) ສະແດງອອກໃນ E. coli ແລະບໍລິສຸດຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນຫນ້ານີ້.5 mM DTT ໄດ້ຖືກລວມເຂົ້າໃນທຸກຂັ້ນຕອນໃນການເຮັດຄວາມສະອາດຂອງ αS cysteine ​​mutants ເພື່ອປ້ອງກັນການສ້າງພັນທະບັດ disulfide.Tau441 isoform (plasmid ທີ່ໄດ້ຮັບຈາກ Addgene #16316), ΔNt-Tau variant (Δ1–150, ໄດ້ຮັບໂດຍການໂຄນ IVA ດ້ວຍ primers CTTTAAGAAGGAGAATACATGATCGCCACACCGGG, CATATGTATATCCTCTCTTTTTAAAGTTAAAC) ແລະ Aggpured-1TCACGATACATATGATCGCCACACCGGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) ແລະ Aggpured-1TCACAu variation ວັດທະນະທໍາ coli ໄດ້ ການຂະຫຍາຍຕົວເປັນ OD600 = 0.6–0.7 ທີ່ 37 ° C ແລະ 180 rpm, ແລະການສະແດງອອກໄດ້ຖືກ induced ກັບ IPTG ສໍາລັບ 3 ຊົ່ວໂມງຢູ່ທີ່ 37 ° C.ການຂຸດຄົ້ນຈຸລັງຢູ່ທີ່ 11,500 xg ເປັນເວລາ 15 ນາທີຢູ່ທີ່ 4 ° C ແລະລ້າງດ້ວຍສານສະກັດຈາກເກືອທີ່ມີ 150 mM NaCl.Resuspend pellet ໃນ lysis buffer (20 ml ຕໍ່ 1 LB: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine 50 μM10, copep.ຂັ້ນຕອນ sonication ໄດ້ຖືກປະຕິບັດເທິງກ້ອນທີ່ມີຄວາມກວ້າງຂອງ 80% ສໍາລັບ 10 pulses (1 ນາທີສຸດ, 1 min off).ບໍ່ເກີນ 60 ມລໃນຫນຶ່ງ ultrasound.E. coli lysates ໄດ້ໃຫ້ຄວາມຮ້ອນຢູ່ທີ່ 95 ° C. ສໍາລັບ 20 ນາທີ, ຫຼັງຈາກນັ້ນເຮັດໃຫ້ເຢັນເທິງກ້ອນແລະ centrifuged ທີ່ 127,000 × g ສໍາລັບ 40 ນາທີ.ທາດ supernatant ທີ່ມີຄວາມກະຈ່າງແຈ້ງໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ກັບເຍື່ອ 3.5 kDa (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) ແລະ dialyzed ຕ້ານ 4 L ຂອງ buffer dialysis (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT. , PMSF 0.1 mM) ສໍາລັບ 10 ຊົ່ວໂມງ.ຖັນແລກປ່ຽນ cation 5 ml (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) ຖືກສົມທຽບກັບ equilibration buffer (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, SF) 0.1 mM.ໄດ້ lysate ໄດ້ຖືກກັ່ນຕອງຜ່ານຕົວກອງ PVDF 0.22 μm ແລະຖືກສີດເຂົ້າໄປໃນຖັນໃນອັດຕາການໄຫຼຂອງ 1 ml / ນາທີ.Elution ໄດ້ດໍາເນີນການເທື່ອລະກ້າວ, tau eluted ກັບ 15-30% elution buffer (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).ເສດສ່ວນຖືກວິເຄາະໂດຍ SDS-PAGE, ແລະສ່ວນໃດສ່ວນໜຶ່ງທີ່ມີແຖບໜຶ່ງທີ່ມີນ້ຳໜັກໂມເລກຸນທີ່ຄາດໄວ້ຂອງ tau ແມ່ນເຂັ້ມຂຸ້ນໂດຍໃຊ້ຕົວກອງ centrifuge 10 kDa ແລະແທນທີ່ດ້ວຍ buffer ທີ່ມີ 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM ແລະ DTT 2 mM ສໍາລັບ ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງທາດໂປຼຕີນສຸດທ້າຍແມ່ນ 100 μM.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ການແກ້ໄຂທາດໂປຼຕີນແມ່ນຜ່ານການກັ່ນຕອງ PVDF 0.22 μm, ແຊ່ແຂງຢ່າງໄວວາແລະເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ -80 ° C.ທາດໂປຼຕີນ K18 ໄດ້ຮັບການສະຫນອງດ້ວຍຄວາມກະລຸນາໂດຍສາດສະດາຈານ Alberto Boffi.ຄວາມບໍລິສຸດຂອງການກະກຽມແມ່ນ >95% ຕາມການຢືນຢັນໂດຍ SDS-PAGE ແລະ MALDI-TOF/TOF.cysteine ​​ຕ່າງໆໄດ້ຖືກຕິດສະຫຼາກທາງເຄມີດ້ວຍ AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) ຫຼື TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada).ໄດ້ຮັບການຢືນຢັນໂດຍການດູດຊຶມແລະ MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau ແລະ K18 ຖືກຕິດສະຫຼາກກັບ cysteine ​​​​native residues ຢູ່ຕໍາແຫນ່ງ 191 ແລະ 322 ໂດຍໃຊ້ Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, ເຢຍລະມັນ) ປະຕິບັດຕາມຂັ້ນຕອນດຽວກັນ.ຄ່າໃຊ້ຈ່າຍສຸດທິຕໍ່ແຜນທີ່ residue ສໍາລັບ αS ແລະ Tau441 ຖືກສ້າງຂຶ້ນໂດຍໃຊ້ CIDER66.
poly-L-lysine ແຂງ (pLK DP 90-110 ອີງຕາມ NMR ຈາກຜູ້ສະຫນອງ, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) ຖືກລະລາຍໃນ 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 ຫາ 10 mM ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນ, ຂະບວນການ sonicated ສໍາລັບ 5. ນາທີໃນອາບນ້ໍາ ultrasonic ແລະເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ -20 ° C.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) ແລະ FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, USA) ແມ່ນນໍ້າລະລາຍ ແລະແຈກຢາຍຢ່າງກວ້າງຂວາງໃນ LLPS buffer.Dialysis ເອົາເກືອທີ່ປົນເປື້ອນ.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ພວກເຂົາເຈົ້າໄດ້ຖືກກັ່ນຕອງໂດຍຜ່ານການກັ່ນຕອງ syringe ທີ່ມີຂະຫນາດ pore ຂອງ 0.22 μm, ແລະຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງພວກມັນຖືກຄິດໄລ່ໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງ refractometer (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA).ຕົວຢ່າງ LLPS ໄດ້ຖືກກະກຽມຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງຕາມລໍາດັບດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້: buffer ແລະ extrusion ໄດ້ຖືກປະສົມແລະ 1 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Ethane- 1, 2-diyldinitrile) ອາຊິດ tetraacetic (EDTA, carboxynth) ແລະປະສົມຂອງ 1% protease inhibitor (PMSF 100 mM, benzimide 1 mM, leupeptin 5 μM).ຫຼັງຈາກນັ້ນ, αS ແລະ polycations fused (ທາງເລືອກ pLK ຫຼື Tau) ຖືກເພີ່ມ.ສໍາລັບການທົດລອງຊຸດເວລາ thioflavin-T (ThT, Carbosynth, Compton, UK), ໃຊ້ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ ThT ທັງໝົດເປັນເຄິ່ງໜຶ່ງຂອງຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງαS.ຄ່ອຍໆແຕ່ປະສົມຕົວຢ່າງຢ່າງລະອຽດເພື່ອຮັບປະກັນວ່າພວກມັນເປັນເນື້ອດຽວກັນ.ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງແຕ່ລະອົງປະກອບແຕກຕ່າງກັນຈາກການທົດລອງໄປຫາການທົດລອງ, ດັ່ງທີ່ອະທິບາຍໄວ້ໃນພາກຜົນໄດ້ຮັບ.Azide ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ໃນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ 0.02% (w/v) ເມື່ອໃດກໍ່ຕາມໄລຍະເວລາຂອງການທົດລອງເກີນ 4 ຊົ່ວໂມງ.ສໍາລັບການວິເຄາະທັງຫມົດໂດຍໃຊ້ຕົວຢ່າງ LLPS, ອະນຸຍາດໃຫ້ປະສົມກັບ 5 ນາທີກ່ອນການວິເຄາະ.ສໍາລັບການວິເຄາະການກະແຈກກະຈາຍແສງສະຫວ່າງ, 150 µl ຂອງຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກໂຫລດໃສ່ microplates 96-well ທີ່ບໍ່ມີການຜູກມັດ (µClear®, ສີດໍາ, F-Bottom / Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) ແລະປົກຫຸ້ມດ້ວຍແຜ່ນກາວ.LLPs ໄດ້ຖືກຕິດຕາມໂດຍການວັດແທກການດູດຊຶມຢູ່ທີ່ 350 nm ຢູ່ໃຈກາງຂອງການແກ້ໄຂໃນເຄື່ອງອ່ານແຜ່ນ CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, ເຢຍລະມັນ).ການທົດລອງໄດ້ຖືກປະຕິບັດໃນ triplicate ຢູ່ທີ່ 25 ° C, ແລະຄວາມຜິດພາດໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ເປັນມາດຕະຖານ deviation ຈາກຄ່າສະເລ່ຍ.ໄລຍະເຈືອຈາງໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍຕົວຢ່າງ centrifugation ແລະການວິເຄາະ SDS-PAGE gel, ແລະສ່ວນ αS ໃນໄລຍະເຈືອຈາງແລະຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໃນການແກ້ໄຂ LLPS ຕ່າງໆ.ຕົວຢ່າງ 100 μl LLPS ທີ່ມີ αS ທີ່ມີປ້າຍຊື່ 1 μM AF488 ໄດ້ຖືກກະກຽມໂດຍການປະສົມຢ່າງລະອຽດປະຕິບັດຕາມດ້ວຍການ centrifugation ທີ່ 9600 × g ເປັນເວລາ 30 ນາທີ, ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ປົກກະຕິແລ້ວການ precipitate ຈະເຫັນໄດ້.ສູງສຸດ 50 μlຂອງ supernatant ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບປະລິມານທາດໂປຼຕີນໂດຍໃຊ້ SDS-PAGE gel.Gels ໄດ້ຖືກສະແກນດ້ວຍຕົວກອງ AF488 ໂດຍໃຊ້ລະບົບການຖ່າຍຮູບເຈນ ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) ຫຼືມີຮອຍເປື້ອນຂອງ Coomassie ແລະສະແດງພາບດ້ວຍຕົວກອງທີ່ເຫມາະສົມ.ແຖບຜົນໄດ້ຮັບໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍໃຊ້ ImageJ ຮຸ່ນ 1.53i (ສະຖາບັນສຸຂະພາບແຫ່ງຊາດ, ສະຫະລັດ).ການທົດລອງໄດ້ຖືກປະຕິບັດຊ້ໍາກັນໃນສອງການທົດລອງທີ່ແຕກຕ່າງກັນທີ່ມີຜົນໄດ້ຮັບທີ່ຄ້າຍຄືກັນ.
ໂດຍປົກກະຕິ, 150 μlຂອງຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ກັບ microplates 96-well ທີ່ບໍ່ມີການຜູກມັດແລະເບິ່ງເຫັນຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງໃນກ້ອງຈຸລະທັດປີ້ນກັບ Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, ເຢຍລະມັນ).ສໍາລັບການທົດລອງຈຸດ, ແຜ່ນ µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, ເຢຍລະມັນ) ຫຼື 96-well polystyrene microplates (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) ຍັງຖືກນໍາໃຊ້.EL6000 halogen ຫຼືໂຄມໄຟ halide ໂລຫະ mercury ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນແຫຼ່ງແສງສະຫວ່າງ (ສໍາລັບການຮູບພາບ BF / DIC ແລະ WF, ຕາມລໍາດັບ).ສໍາລັບກ້ອງຈຸລະທັດ WF, ຈຸດປະສົງທາງອາກາດຂະຫຍາຍ 40x (Leica Microsystems, ເຢຍລະມັນ) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອສຸມໃສ່ແສງສະຫວ່າງໃສ່ຕົວຢ່າງແລະເກັບກໍາມັນ.ສໍາລັບຕົວຢ່າງທີ່ຕິດສະຫຼາກ AF488 ແລະ ThT, ການກັ່ນຕອງຄວາມຕື່ນເຕັ້ນແລະການປ່ອຍອາຍພິດກັບຊຸດການກັ່ນຕອງ GFP ມາດຕະຖານ, ການກັ່ນຕອງ bandpass excitation ແລະການປ່ອຍອາຍພິດ, ຕາມລໍາດັບ, ການກັ່ນຕອງ bandpass 460–500 nm ແລະ 512–542 nm, ແລະບ່ອນແລກປ່ຽນຄວາມ 495 nm dichroic.ສໍາລັບຕົວຢ່າງທີ່ຕິດສະຫຼາກດ້ວຍ Atto647N, ຊຸດມາດຕະຖານຂອງຕົວກອງ Cy5 ທີ່ມີຄວາມຕື່ນເຕັ້ນແລະຕົວກອງ bandpass ການປ່ອຍອາຍພິດ 628–40 nm ແລະ 692–40 nm, ຕາມລໍາດັບ, ແລະກະຈົກ dichroic 660 nm.ສໍາລັບກ້ອງຈຸລະທັດ BF ແລະ DIC, ໃຫ້ໃຊ້ຈຸດປະສົງການເກັບແສງສະທ້ອນອັນດຽວກັນ.ແສງສະຫວ່າງທີ່ເກັບກໍາໄດ້ຖືກບັນທຶກໄວ້ໃນກ້ອງຖ່າຍຮູບ Leica DFC7000 CCD (Leica Microsystems, ເຢຍລະມັນ).ເວລາການຮັບແສງແມ່ນ 50 ms ສໍາລັບການຖ່າຍຮູບກ້ອງຈຸລະທັດ BF ແລະ DIC ແລະ 20-100 ms ສໍາລັບການຖ່າຍຮູບກ້ອງຈຸລະທັດ WF.ສໍາລັບການປຽບທຽບ, ເວລາການເປີດເຜີຍສໍາລັບການທົດລອງທັງຫມົດທີ່ມີ ThT ແມ່ນ 100 ms.ການ​ທົດ​ລອງ​ການ​ໃຊ້​ເວ​ລາ​ໄດ້​ຖືກ​ປະ​ຕິ​ບັດ​ເພື່ອ​ໃຫ້​ເຫັນ​ພາບ​ຂອງ droplet coalescence​, ໂດຍ​ທີ່​ຈະ​ເກັບ​ກໍາ​ຮູບ​ພາບ​ໃນ​ທຸກໆ 100 ms ເປັນ​ເວ​ລາ​ຫຼາຍ​ນາ​ທີ​.ImageJ (NIH, USA) ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການວິເຄາະຮູບພາບ.ການທົດລອງໄດ້ຖືກປະຕິບັດເປັນ triplicate ດ້ວຍຜົນໄດ້ຮັບທີ່ຄ້າຍຄືກັນ.
ສໍາລັບການທົດລອງ colocalization, FRAP ແລະ 3D reconstruction, ຮູບພາບຕ່າງໆໄດ້ມາຢູ່ໃນກ້ອງຈຸລະທັດ confocal inverted Zeiss LSM 880 ໂດຍໃຊ້ ZEN 2 blue edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany).ຕົວຢ່າງຂອງ 50 µl ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ກັບຖ້ວຍ µ-Slide Angiogenesis Petri (Ibidi GmbH, Gröfelfing, ເຢຍລະມັນ), ປິ່ນປົວດ້ວຍໂພລີເມີໄຮໂດຼລິກ (ibiTreat) ແລະຕິດຢູ່ໃນຈຸດປະສົງການແຊ່ນ້ໍາ 63 × (Plan-Apochromat 63 × / NA 1.4 ນ້ໍາມັນ) ໃນ DIC).ຮູບພາບໄດ້ມາໂດຍໃຊ້ເສັ້ນເລເຊີ 458 nm, 488 nm, ແລະ 633 nm argon ທີ່ມີຄວາມລະອຽດ 0.26 µm/pixel ແລະເວລາເປີດຮັບແສງ 8 µs/pixel ສໍາລັບປ່ອງຢ້ຽມກວດຈັບການກະຕຸ້ນແລະການປ່ອຍອາຍພິດຂອງ 470–600 nm, 493–628 nm. ແລະ 638–755 nm ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອເບິ່ງເຫັນ ThT, AF488 ແລະ Atto647N, ຕາມລໍາດັບ.ສໍາລັບການທົດລອງ FRAP, ການຖ່າຍຮູບ time-lapse ຂອງແຕ່ລະຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກບັນທຶກໄວ້ດ້ວຍ 1 ເຟຣມຕໍ່ວິນາທີ.ການທົດລອງໄດ້ຖືກປະຕິບັດເປັນ triplicate ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງທີ່ມີຜົນໄດ້ຮັບທີ່ຄ້າຍຄືກັນ.ຮູບພາບທັງຫມົດໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍໃຊ້ Zen 2 blue edition software (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany).ເສັ້ນໂຄ້ງ FRAP ໄດ້ຖືກປັບຕາມປົກກະຕິ, ວາງແຜນ ແລະ ປັບໃຫ້ເໝາະສົມກັບຂໍ້ມູນຄວາມເຂັ້ມ/ເວລາທີ່ສະກັດຈາກຮູບພາບໂດຍໃຊ້ Zen 2 ໂດຍໃຊ້ OriginPro 9.1.ເສັ້ນໂຄ້ງການຟື້ນຕົວໄດ້ຖືກປັບເຂົ້າກັບແບບຈໍາລອງ mono-exponential ເພື່ອບັນຊີສໍາລັບການແຜ່ກະຈາຍຂອງໂມເລກຸນທີ່ມີໄລຍະ exponential ເພີ່ມເຕີມເພື່ອບັນຊີສໍາລັບຜົນກະທົບ bleaching ທີ່ໄດ້ມາ.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ພວກເຮົາຄິດໄລ່ D ໂດຍໃຊ້ລັດສະຫມີສີຟອກໃນນາມແລະເຄິ່ງຊີວິດການຟື້ນຕົວທີ່ໄດ້ກໍານົດໄວ້ກ່ອນຫນ້ານີ້ຄືກັບໃນສົມຜົນຂອງ Kang et al.5 35 ສະແດງໃຫ້ເຫັນ.
ຕົວແປ cysteine ​​​​ດ່ຽວຂອງ αS ໄດ້ຖືກສັງເຄາະດ້ວຍ 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) ຢູ່ຕໍາແຫນ່ງ 24 (TEMPOL-24-αS) ແລະ 122 (TEMPOL-122-αS), ຕາມລໍາດັບ.Spin Labeling ສໍາລັບການທົດລອງ EPR, ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນ αS ຖືກກໍານົດຢູ່ທີ່ 100 μM ແລະຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ PEG ແມ່ນ 15% (w / v).ສໍາລັບເງື່ອນໄຂການລວບລວມຕ່າງໆ, ອັດຕາສ່ວນ αS:pLK ແມ່ນ 1:10, ໃນຂະນະທີ່ອັດຕາສ່ວນ αS:ΔNt-Tau ແລະ αS:Tau441 ຖືກຮັກສາໄວ້ຢູ່ທີ່ 1:1.ສໍາລັບການທົດລອງ titration ຜູກມັດໃນເວລາທີ່ບໍ່ມີຝູງຊົນ, TEMPOL-122-αS ໄດ້ຖືກຮັກສາໄວ້ຢູ່ທີ່ 50 μM ແລະ polycations ໄດ້ຖືກ titrated ຢູ່ທີ່ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນທີ່ເພີ່ມຂຶ້ນ, ການກະກຽມແຕ່ລະເງື່ອນໄຂແຍກຕ່າງຫາກ.ການວັດແທກ CW-EPR ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ Bruker ELEXSYS E580 X-band spectrometer ທີ່ມີເຄື່ອງ resonator Bruker ER4118 SPT-N1 ທີ່ປະຕິບັດງານຢູ່ທີ່ຄວາມຖີ່ຂອງໄມໂຄເວຟ (SHF) ຂອງ ~ 9.7 GHz.ອຸນ​ຫະ​ພູມ​ໄດ້​ຖືກ​ກໍາ​ນົດ​ໄວ້​ທີ່ 25°C ແລະ​ຄວບ​ຄຸມ​ໂດຍ cryostat ໄນ​ໂຕຣ​ເຈນ​ໄວ້​ເປັນ​ຂອງ​ແຫຼວ​.spectra ໄດ້ຮັບພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂທີ່ບໍ່ອີ່ມຕົວຢູ່ທີ່ພະລັງງານ MW ຂອງ 4 mW, ຄວາມກວ້າງຂອງ modulation ຂອງ 0.1 mT, ແລະຄວາມຖີ່ຂອງ modulation ຂອງ 100 kHz.ຄວາມເຂັ້ມງວດຂອງ Spectral ໄດ້ຖືກປັບປຸງເປັນປົກກະຕິເພື່ອຫຼີກເວັ້ນຄວາມແຕກຕ່າງຂອງຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ spin ລະຫວ່າງຕົວຢ່າງແລະການຫຼຸດຜ່ອນການ spin ທີ່ເປັນໄປໄດ້ເນື່ອງຈາກຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງສານທີ່ຕົກຄ້າງຢູ່ໃນຕົວຢ່າງທີ່ມີ Tau441 ຫຼື ΔNt-Tau (ປະຈຸບັນຢູ່ໃນການແກ້ໄຂທາດໂປຼຕີນຈາກຕົ້ນສະບັບ).ຄ່າທີ່ໄດ້ຮັບຂອງ g ແມ່ນໄດ້ຮັບເປັນຜົນມາຈາກການສ້າງແບບຈໍາລອງ EPR spectral ປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ຊອບແວ Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) ປະຕິບັດໃນMatlab®67.ຕົວແບບ isotropic ໜຶ່ງ/ສອງອົງປະກອບຖືກໃຊ້ເພື່ອສ້າງແບບຈໍາລອງຂໍ້ມູນ.ຫຼັງຈາກການເຮັດໃຫ້ສັນຍານທັງຫມົດເປັນປົກກະຕິ, ສ່ວນທີ່ເຫຼືອໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍການຫັກລົບແຕ່ລະ simulation ຈາກ spectrum ທົດລອງທີ່ສອດຄ້ອງກັນ.ສໍາລັບການວິເຄາະ titration ການຜູກມັດ, ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງແຖບທີສາມກັບແຖບທີສອງຂອງ EPR spectrum ປົກກະຕິ (IIII/III) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອຕິດຕາມກວດກາການຜູກມັດຂອງ polycations ກັບ αS.ເພື່ອປະເມີນຄ່າຄົງທີ່ dissociation (Kd), ເສັ້ນໂຄ້ງທີ່ໄດ້ຮັບຜົນໄດ້ຖືກປັບເຂົ້າກັບຕົວແບບໂດຍປະມານທີ່ສົມມຸດວ່າສະຖານທີ່ຜູກມັດທີ່ຄືກັນ ແລະເປັນເອກະລາດ.
ການທົດລອງ spectroscopy NMR ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR spectrometer ທີ່ຕິດຕັ້ງດ້ວຍ cryoprobe ແລະ Z-gradient.ການທົດລອງທັງໝົດໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ 130–207 µM αS ແລະ αS/ΔNt-Tau ແລະ pLK ທີ່ສອດຄ້ອງກັນໃນ 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 ແລະຖືກປະຕິບັດຢູ່ທີ່ 15 ° C.ເພື່ອຕິດຕາມ LPS ໂດຍ NMR, 10% PEG ໄດ້ຖືກເພີ່ມໃສ່ຕົວຢ່າງທີ່ປະສົມກ່ອນ.ດິນຕອນຂອງການປ່ຽນແປງທາງເຄມີ perturbation (ຮູບ 1b) ສະແດງໃຫ້ເຫັນການປ່ຽນແປງທາງເຄມີໂດຍສະເລ່ຍ 1H ແລະ 15N.αS 2D1H-15N HSQC spectra ໄດ້ຖືກມອບຫມາຍໂດຍອີງໃສ່ການມອບຫມາຍທີ່ຜ່ານມາ (BMRB entry #25227) ແລະຢືນຢັນໂດຍການບັນທຶກແລະການວິເຄາະ spectra 3D ຂອງ HNCA, HNCO ແລະ CBCAcoNH.ການປ່ຽນແປງທາງເຄມີ 13Cα ແລະ 13Cβ ໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ຢູ່ໃນທີ່ປະທັບຂອງ ΔNt-Tau ຫຼື pLK ເພື່ອວັດແທກການປ່ຽນແປງທີ່ເປັນໄປໄດ້ໃນແນວໂນ້ມໂຄງສ້າງຂັ້ນສອງເມື່ອທຽບກັບ αS ການປ່ຽນແປງທາງເຄມີໃນຄວາມສອດຄ່ອງຂອງທໍ່ສຸ່ມທີ່ບໍລິສຸດ 68 (ຮູບພາບເສີມ 5c).ອັດຕາ R1ρ ໄດ້ຖືກວັດແທກໂດຍການບັນທຶກການທົດລອງ hsqctretf3gpsi (ໄດ້ມາຈາກຫ້ອງສະຫມຸດ Bruker) ດ້ວຍຄວາມລ່າຊ້າຂອງ 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, ແລະ 800 ms, ແລະຟັງຊັນ exponential ໄດ້ຖືກປັບກັບຄວາມລ່າຊ້າຂອງຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສູງສຸດ. ເວລາເພື່ອກໍານົດ R1ρ ແລະຄວາມບໍ່ແນ່ນອນໃນການທົດລອງຂອງມັນ.
ການທົດລອງກ້ອງຈຸລະທັດ fluorescence ແກ້ໄຂເວລາສອງສີໄດ້ດໍາເນີນຢູ່ໃນ MT200 fluorescence confocal microscope ແກ້ໄຂເວລາທາງການຄ້າ (PicoQuant, Berlin, ເຢຍລະມັນ) ທີ່ມີອຸປະກອນການນັບ photon ດຽວ (TCSPC).ຫົວ diode laser ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການກະຕຸ້ນ interleaved pulsed (PIE), beam ຜ່ານ waveguide ຮູບແບບດຽວແລະຖືກ tuned ກັບພະລັງງານ laser ຂອງ 10 ຫາ 100 nW ສໍາລັບສາຍ laser 481 nm ແລະ 637 nm ວັດແທກຫຼັງຈາກກະຈົກ dichroic.ນີ້​ຮັບ​ປະ​ກັນ​ອັດ​ຕາ​ການ​ນັບ photon ທີ່​ດີ​ທີ່​ສຸດ​, ຫຼີກ​ເວັ້ນ​ການ​ຜົນ​ກະ​ທົບ​ຂອງ photon aliasing​, photobleaching ແລະ​ການ​ອີ່ມ​ຕົວ​.μ-Slide angiogenesis coverslips ຫຼືແຜ່ນ (Ibidi GmbH, Gräfelfing, ເຢຍລະມັນ) ໄດ້ຖືກຈັດໃສ່ໂດຍກົງໃນນ້ໍາ immersion ໃນໄລຍະທັດສະນະ Super Apochromat 60x NA 1.2 ທີ່ມີຄໍແກ້ໄຂ (Olympus Life Sciences, Waltham, USA).A 488/640 nm dichroic mirror (Semrock, Lake Forest, IL, USA) ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນ beam splitter ຕົ້ນຕໍ.ລັງສີທີ່ບໍ່ໄດ້ສຸມໃສ່ຖືກສະກັດໂດຍຂຸມທີ່ມີເສັ້ນຜ່າກາງ 50 ໄມຄຣອນ, ຫຼັງຈາກນັ້ນລັງສີທີ່ສຸມໃສ່ໄດ້ຖືກແບ່ງອອກເປັນ 2 ເສັ້ນທາງການຊອກຄົ້ນຫາໂດຍຕົວແຍກ beam 50/50.ການກັ່ນຕອງການປ່ອຍອາຍພິດ Bandpass (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 ສໍາລັບສີຍ້ອມສີຂຽວ (AF488) ແລະ 690/70 ສໍາລັບສີຍ້ອມສີແດງ (Atto647N) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ຢູ່ທາງຫນ້າຂອງເຄື່ອງກວດຈັບ.ໄດໂອດ avalanche avalanche ດຽວ (SPAD) (ອຸປະກອນ Micro Photon, Bolzano, Italy) ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນເຄື່ອງກວດຈັບ.ທັງສອງການເກັບກຳຂໍ້ມູນ ແລະການວິເຄາະແມ່ນໄດ້ດຳເນີນໂດຍໃຊ້ຊອບແວ SymphoTime64 ທີ່ມີໃນການຄ້າ (PicoQuant GmbH, Berlin, Germany).
ຫ້າສິບໄມໂຄລິດຂອງຕົວຢ່າງ LLPS ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ກັບ μ-Slide angiogenesis wells (Ibidi GmbH, Gräfelfing, ເຢຍລະມັນ).ຮູບພາບຜົນໄດ້ຮັບແມ່ນສຸມໃສ່ 20 µm ຂ້າງເທິງທາງລຸ່ມຂອງດີສໍາລັບໄລຍະການເຮັດວຽກທີ່ເຫມາະສົມທີ່ສຸດສໍາລັບ droplets suspended ແລະ ~ 1 µm ສໍາລັບ rafts ແລະ dots ທີ່ມີຄວາມລະອຽດເປັນແກນຢ່າງຫນ້ອຍ 0.25 µm / pixels ແລະເວລາຊັກຊ້າ 400 µs / pixels.ເລືອກຂໍ້ມູນໂດຍການໃຊ້ຂອບເຂດຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນໂດຍອີງໃສ່ຄວາມເຂັ້ມຂອງສັນຍານພື້ນຖານສະເລ່ຍ (PBG, mean + 2σ) ສໍາລັບແຕ່ລະຊ່ອງເພື່ອໃຫ້ພຽງແຕ່ droplets ທາດໂປຼຕີນຂອງແຫຼວ, rafts, ຫຼືຈຸດທີ່ຖືກຄັດເລືອກ, ການກັ່ນຕອງອອກຕົ້ນກໍາເນີດທີ່ເປັນໄປໄດ້ຈາກໄລຍະການກະຈາຍ.ເພື່ອວິເຄາະອາຍຸຂອງແຕ່ລະຊະນິດ (τ) ຂອງແຕ່ລະຊ່ອງ (ສີຂຽວ, “g” ສໍາລັບ AF488 ແລະສີແດງ, “r” ສໍາລັບ Atto647N), ພວກເຮົາໄດ້ເລືອກຂົງເຂດທີ່ມີຄວາມສົນໃຈ (ROIs) ທີ່ມີ droplets, rafts, ຫຼືຈຸດ (ຮູບເພີ່ມເຕີມ 1. ).8b) ແລະໄດ້ມາໃຫ້ເຂົາເຈົ້າໂດຍ fitting ການທໍາລາຍຕະຫຼອດຊີວິດຂອງເຂົາເຈົ້າ (τD, τR ແລະ τP ສໍາລັບ droplets, rafts ຫຼືຈຸດ, ຕາມລໍາດັບ, ເບິ່ງການເສີມ Fig. 8c) ໃນແຕ່ລະຊ່ອງທາງການນໍາໃຊ້ການວິເຄາະຫາງແລະຮູບແບບການທໍາລາຍສອງອົງປະກອບ.ສະເລ່ຍ τ ຈາກ τ .ROIs ທີ່ຜະລິດໂຟຕອນໜ້ອຍເກີນໄປສໍາລັບຄວາມສອດຄ່ອງຫຼາຍເລກກຳລັງຖືກຍົກເວັ້ນຈາກການວິເຄາະ.ການຕັດອອກທີ່ໃຊ້ແມ່ນ <104 photons ສໍາລັບ rafts ແລະ dots ແລະ 103 ສໍາລັບ drops.droplets ມີເກນຕ່ໍາເນື່ອງຈາກວ່າມັນເປັນການຍາກທີ່ຈະໄດ້ຮັບເສັ້ນໂຄ້ງທີ່ເສື່ອມໂຊມທີ່ມີຄ່າຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນທີ່ສູງຂຶ້ນ, ເນື່ອງຈາກວ່າ droplets ຢູ່ໃນພາກສະຫນາມຮູບພາບປົກກະຕິແລ້ວມີຂະຫນາດນ້ອຍກວ່າແລະມີຈໍານວນຫນ້ອຍ.ROIs ທີ່ມີຈໍານວນ photon ເກີນຂອບເຂດຈໍາກັດການສະສົມ photon (ຕັ້ງເປັນ > 500 counts/pixel) ຍັງຖືກຍົກເລີກສໍາລັບການວິເຄາະ.ຈັບຄູ່ເສັ້ນໂຄ້ງການເສື່ອມໂຊມຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນທີ່ໄດ້ຮັບຈາກພາກພື້ນທີ່ມີຄວາມສົນໃຈທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຢູ່ທີ່ 90% ຂອງສູງສຸດ (ເລັກນ້ອຍຫຼັງຈາກຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສູງສຸດ) ຈາກການເລີ່ມຕົ້ນຂອງຊີວິດການບໍລິການເພື່ອຮັບປະກັນການແຊກແຊງຂອງ IRF ໜ້ອຍທີ່ສຸດ ໃນຂະນະທີ່ຮັກສາຄວາມເຂັ້ມງວດຂອງຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນທັງໝົດ. settings ປ່ອງຢ້ຽມເວລາທີ່ກ່ຽວຂ້ອງໄດ້ຖືກວິເຄາະ 25 ຫາ 50 ROI ສໍາລັບ rafts ແລະຈຸດແລະ 15-25 ROI ສໍາລັບການຫຼຸດລົງ, ຮູບພາບທີ່ເລືອກຈາກຫຼາຍກວ່າ 4 replicates ບັນທຶກຈາກຢ່າງຫນ້ອຍ 3 ການທົດລອງເອກະລາດ.ການທົດສອບ t-tailed ສອງຫາງໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອປະເມີນຄວາມແຕກຕ່າງທາງສະຖິຕິລະຫວ່າງຊະນິດພັນຫຼືລະຫວ່າງລະບົບ coacervate.ສໍາລັບການວິເຄາະ pixel-by-pixel ຂອງຕະຫຼອດຊີວິດ (τ), ການຫຼຸດຫນ້ອຍລົງຂອງຊີວິດຕະຫຼອດການພາກສະຫນາມສໍາລັບແຕ່ລະຊ່ອງໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ແລະການປະມານຂອງຕົວແບບການຫຼຸດຫນ້ອຍລົງຂອງ exponential ອົງປະກອບ 2/3 ໄດ້ຖືກປະຕິບັດ.ການຫຼຸດໜ້ອຍຖອຍລົງຕະຫຼອດຊີວິດຂອງແຕ່ລະ pixels ຈະຖືກປັບໃຫ້ພໍດີໂດຍໃຊ້ຄ່າ τ ທີ່ຄຳນວນໄວ້ກ່ອນໜ້ານີ້, ສົ່ງຜົນໃຫ້ຮູບ pseudocolor FLIM ພໍດີ.ຊ່ວງອາຍຸທີ່ພໍດີກັບຫາງແມ່ນຄືກັນໃນທົ່ວທຸກຮູບຂອງຊ່ອງດຽວກັນ, ແລະການເສື່ອມໂຊມແຕ່ລະອັນໄດ້ຜະລິດໂຟຕອນພຽງພໍເພື່ອໃຫ້ຄວາມສອດຄ່ອງທີ່ເຊື່ອຖືໄດ້.ສໍາ​ລັບ​ການ​ວິ​ເຄາະ FRET​, pixels ໄດ້​ຖືກ​ຄັດ​ເລືອກ​ໂດຍ​ການ​ນໍາ​ໃຊ້​ມາດ​ຕະ​ຖານ​ຄວາມ​ເຂັ້ມ​ຕ​່​ໍ​າ​ຂອງ 100 photons​, ເຊິ່ງ​ສະ​ເລ່ຍ​ສັນ​ຍານ​ພື້ນ​ຖານ (FBG​) ຂອງ 11 photons​.ຄວາມເຂັ້ມ fluorescence ຂອງແຕ່ລະຊ່ອງໄດ້ຖືກແກ້ໄຂໂດຍປັດໃຈການແກ້ໄຂທີ່ກໍານົດໃນການທົດລອງ: 69 spectral crosstalk αແມ່ນ 0.004, β excitation ໂດຍກົງແມ່ນ 0.0305, ປະສິດທິພາບການຊອກຄົ້ນຫາ γ ແມ່ນ 0.517.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ປະສິດທິພາບ FRET ໃນລະດັບ pixel ແມ່ນຄິດໄລ່ໂດຍໃຊ້ສົມຜົນຕໍ່ໄປນີ້:
ບ່ອນທີ່ FDD ແມ່ນຄວາມເຂັ້ມ fluorescence ສັງເກດເຫັນຢູ່ໃນຊ່ອງທາງຜູ້ໃຫ້ທຶນ (ສີຂຽວ), FDA ແມ່ນຄວາມເຂັ້ມ fluorescence ສັງເກດເຫັນຢູ່ໃນຊ່ອງຮັບ (ສີແດງ) ພາຍໃຕ້ຄວາມຕື່ນເຕັ້ນທາງອ້ອມ, ແລະ FAA ແມ່ນຄວາມເຂັ້ມ fluorescence ສັງເກດເຫັນຢູ່ໃນຊ່ອງຮັບ (ສີແດງ) ພາຍໃຕ້ການຕື່ນເຕັ້ນໂດຍກົງ ( PIE).ກໍາມະຈອນທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ fluorescence ແມ່ນສັງເກດເຫັນຢູ່ໃນຊ່ອງທາງ).
ວາງ 100 µl ຂອງການແກ້ໄຂປະຕິກິລິຍາ LLPS ບັນຈຸ 25 µM monomeric ທີ່ບໍ່ມີປ້າຍຊື່ Tau441 (ມີຫຼືບໍ່ມີ 25 µM αS) ໃນ LLPS buffer (ເພີ່ມເຕີມດັ່ງຂ້າງເທິງ) ໃສ່ microplates 96 ດີທີ່ບໍ່ຜູກມັດດ້ວຍການເຄືອບ foil ກາວແລະການສ້າງຕັ້ງ droplet ໄດ້ຖືກກວດສອບໂດຍ microplates ຫຼັງຈາກ WF. ຄວາມສົມດຸນ.ພາຍໃນ 10 ນທ.ຫຼັງ​ຈາກ 48 ຊົ່ວ​ໂມງ​ຂອງ incubation ໃນ​ອຸນ​ຫະ​ພູມ​ຫ້ອງ​, ການ​ມີ​ຂອງ rafts ທາດ​ໂປຼ​ຕີນ​ແລະ​ຈຸດ​ໄດ້​ຮັບ​ການ​ຢືນ​ຢັນ​.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ເອົາຂອງແຫຼວໃສ່ເທິງ rafts ອອກຈາກດີ, ຫຼັງຈາກນັ້ນຕື່ມ 50 L ຂອງ dissociation buffer (10 mM HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) ແລະ incubate ສໍາລັບ 10 ນາທີ.ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງເກືອສູງຮັບປະກັນວ່າ LLPS ຈະບໍ່ເຮັດຊ້ໍາອີກເນື່ອງຈາກ PEG ທີ່ເຫຼືອ, ແລະການປະກອບທາດໂປຼຕີນທີ່ເປັນໄປໄດ້ທີ່ສ້າງຂຶ້ນໂດຍປະຕິສໍາພັນ electrostatic ເທົ່ານັ້ນຈະຖືກຖອດອອກ.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ດ້ານລຸ່ມຂອງນໍ້າສ້າງໄດ້ຖືກຂູດອອກຢ່າງລະມັດລະວັງດ້ວຍປາຍ micropipette ແລະການແກ້ໄຂຜົນໄດ້ຮັບໄດ້ຖືກໂອນໄປຫາບ່ອນສັງເກດການຫວ່າງເປົ່າ.ຫຼັງຈາກ incubation ຂອງຕົວຢ່າງທີ່ມີ 50 μM ThT ສໍາລັບ 1 h, ການປະກົດຕົວຂອງຈຸດທີ່ໂດດດ່ຽວໄດ້ຖືກກວດສອບໂດຍ WF microscopy.ກະກຽມ sonicated αS fibrils ໂດຍການ incubating 300 µl ຂອງການແກ້ໄຂ 70-µM αS ໃນ PBS ກັບ pH 7.4, sodium azide 0.01% ຢູ່ 37 ° C ແລະ 200 rpm ສຸດ shaker orbital ສໍາລັບ 7 ມື້.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ການແກ້ໄຂໄດ້ຖືກ centrifuged ຢູ່ 9600 × g ສໍາລັບ 30 ນາທີ, pellet ໄດ້ resuspended ໃນ PBS pH 7.4 ແລະ sonicated (1 min, 50% ວົງຈອນ, 80% ຄວາມກວ້າງຂອງຂວາງໃນ Vibra-Cell VC130 sonicator, Sonics, Newton, USA) fibril ຕົວຢ່າງ. ມີການແຜ່ກະຈາຍຂະຫນາດທີ່ຂ້ອນຂ້າງເປັນເອກະພາບຂອງ fibrils ຂະຫນາດນ້ອຍ.
ການວິເຄາະ FCS/FCCS ແລະການກວດຫາຄວາມບັງເອີນສອງສີ (TCCD) ໄດ້ຖືກປະຕິບັດຢູ່ໃນກ້ອງຈຸລະທັດ fluorescent confocal ທີ່ແກ້ໄຂເວລາ MT200 ດຽວກັນ (Pico-Quant, Berlin, ເຢຍລະມັນ) ທີ່ໃຊ້ສໍາລັບການທົດລອງກ້ອງຈຸລະທັດ FLIM-FRET ໂດຍໃຊ້ໂໝດ PIE.ພະລັງງານເລເຊີສໍາລັບການທົດລອງເຫຼົ່ານີ້ໄດ້ຖືກເພີ່ມເຂົ້າໄປໃນ 6.0 µW (481 nm) ແລະ 6.2 µW (637 nm).ການປະສົມປະສານຂອງພະລັງງານເລເຊີເຫຼົ່ານີ້ໄດ້ຖືກເລືອກເພື່ອຜະລິດຄວາມສະຫວ່າງທີ່ຄ້າຍຄືກັນສໍາລັບຄູ່ຂອງ fluorophores ທີ່ໃຊ້ໃນຂະນະທີ່ບັນລຸອັດຕາການນັບທີ່ດີທີ່ສຸດແລະຫຼີກເວັ້ນການ photobleaching ແລະການອີ່ມຕົວ.ທັງສອງການເກັບກຳຂໍ້ມູນ ແລະການວິເຄາະໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ຊອຟແວ SymphoTime64 ເວີຊັ່ນ 2.3 ທີ່ມີຂາຍໃນການຄ້າ (PicoQuant, Berlin, Germany).
ຕົວຢ່າງຂອງສານລວມ αS/Tau ທີ່ໂດດດ່ຽວທີ່ໄດ້ຮັບໂດຍໃຊ້ LLPS ແມ່ນເຈືອຈາງໃນ buffer ໂດດດ່ຽວໄປສູ່ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງໂມໂມເລກຸນທີ່ເຫມາະສົມ (ໂດຍປົກກະຕິເປັນການເຈືອຈາງ 1:500, ເພາະວ່າການລວມຕົວມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຕໍ່າແລ້ວເມື່ອຖືກແຍກອອກຈາກຕົວຢ່າງ coacervate).ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກ ນຳ ໃຊ້ໂດຍກົງໃສ່ຝາປິດ (Corning, USA) ທີ່ຖືກເຄືອບດ້ວຍການແກ້ໄຂ BSA ໃນຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ 1 mg/mL.
ສໍາລັບການວິເຄາະ PIE-smFRET ໃນຊ່ອງສີຂຽວແລະສີແດງ, ຂອບເຂດຄວາມເຂັ້ມຕ່ໍາຂອງ 25 ໂຟຕອນໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອການກັ່ນຕອງສັນຍານຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຕ່ໍາທີ່ເກີດຈາກເຫດການ monomeric (ສັງເກດວ່າ monomers ມີຈໍານວນຕົວຢ່າງລວມທຽບກັບຕົວລວມທີ່ໂດດດ່ຽວ).ເກນນີ້ໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ເປັນຫ້າເທົ່າຂອງຄວາມເຂັ້ມງວດສະເລ່ຍຂອງ monomeric αS ທີ່ໄດ້ຮັບຈາກການວິເຄາະຕົວຢ່າງ monomer ບໍລິສຸດເພື່ອເລືອກສະເພາະສໍາລັບການວິເຄາະ.ວົງຈອນຂັບ PIE, ຮ່ວມກັນກັບການຊື້ຂໍ້ມູນ TSCPC, ໄດ້ເປີດໃຊ້ຄໍາຮ້ອງສະຫມັກຂອງການກັ່ນຕອງນ້ໍາຫນັກຕະຫຼອດຊີວິດທີ່ຊ່ວຍກໍາຈັດພື້ນຫລັງແລະ spectral crosstalk.ຄວາມເຂັ້ມຂອງໄຟທີ່ເລືອກໂດຍໃຊ້ເກນຂ້າງເທິງນີ້ໄດ້ຖືກແກ້ໄຂໂດຍໃຊ້ສັນຍານພື້ນຫຼັງສະເລ່ຍທີ່ກຳນົດຈາກ histograms ຂອງການປະກົດຕົວທຽບກັບຄວາມເຂັ້ມ/bin ຂອງຕົວຢ່າງ buffer ເທົ່ານັ້ນ.bursts ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການລວບລວມຂະຫນາດໃຫຍ່ໂດຍປົກກະຕິຈະຄອບຄອງຫຼາຍຖັງຕິດຕໍ່ກັນໃນການຕິດຕາມເວລາ (ຕັ້ງເປັນ 1 ms).ໃນກໍລະນີເຫຼົ່ານີ້, ຖັງທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມແຂງສູງສຸດໄດ້ຖືກເລືອກ.ສໍາລັບການວິເຄາະ FRET ແລະ stoichiometric, ປັດໄຈ gamma γ (0.517) ທີ່ກໍານົດທາງທິດສະດີໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້.Spectral crosstalk ແລະການປະກອບສ່ວນຄວາມຕື່ນເຕັ້ນໂດຍກົງແມ່ນບໍ່ມີເຫດຜົນ (ກໍານົດການທົດລອງ) ຢູ່ທີ່ພະລັງງານ laser excitation ທີ່ໃຊ້.ປະສິດທິພາບແລະ stoichiometry ຂອງ FRET ໃນການລະເບີດໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້.