347 ອົງປະກອບທາງເຄມີຂອງທໍ່ທໍ່ເຫຼັກສະແຕນເລດ, ການກໍານົດຕົວຕົນຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ leukocyte antigen-A (HLA-A) ຂອງມະນຸດທີ່ຕອບສະຫນອງ interferon ໃຫມ່ໂດຍໃຊ້ spectrometry ມະຫາຊົນ (CLMS)

ຂໍ​ຂອບ​ໃຈ​ທ່ານ​ສໍາ​ລັບ​ການ​ຢ້ຽມ​ຢາມ Nature.com​.ທ່ານກໍາລັງໃຊ້ເວີຊັນຂອງຕົວທ່ອງເວັບທີ່ມີການສະຫນັບສະຫນູນ CSS ຈໍາກັດ.ເພື່ອປະສົບການທີ່ດີທີ່ສຸດ, ພວກເຮົາແນະນຳໃຫ້ທ່ານໃຊ້ບຣາວເຊີທີ່ອັບເດດແລ້ວ (ຫຼືປິດການນຳໃຊ້ໂໝດຄວາມເຂົ້າກັນໄດ້ໃນ Internet Explorer).ນອກຈາກນັ້ນ, ເພື່ອຮັບປະກັນການສະຫນັບສະຫນູນຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ, ພວກເຮົາສະແດງເວັບໄຊທ໌ທີ່ບໍ່ມີຮູບແບບແລະ JavaScript.
ຕົວເລື່ອນສະແດງສາມບົດຄວາມຕໍ່ສະໄລ້.ໃຊ້ປຸ່ມດ້ານຫຼັງ ແລະປຸ່ມຕໍ່ໄປເພື່ອເລື່ອນຜ່ານສະໄລ້, ຫຼືປຸ່ມຄວບຄຸມສະໄລ້ຢູ່ທ້າຍເພື່ອເລື່ອນຜ່ານແຕ່ລະສະໄລ້.

ລາຍ​ລະ​ອຽດ​ຜະ​ລິດ​ຕະ​ພັນ

Stainless Steel 347L Coil Tubes, Steel Grade: SS347L

ລະບົບສັນຍານ interferon induces ການຕອບສະຫນອງຂອງ cytokine ທີ່ເຂັ້ມແຂງກັບລະດັບຄວາມກ້ວາງຂອງສັນຍານ pathological ພາຍໃນແລະພາຍໃນຈາກສະພາບແວດລ້ອມ, ສົ່ງຜົນໃຫ້ induction ຂອງ subsets ຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ interferon-inducible.ພວກເຮົາໄດ້ນຳໃຊ້ DSS-mediated cross-link mass spectrometry (CLMS) ເພື່ອກວດຫາປະຕິສຳພັນໂປຣຕິນ-ໂປຣຕີນໃໝ່ໃນໂດເມນຂອງໂປຣຕີນທີ່ເກີດຈາກ interferon.ນອກເໜືອໄປຈາກໂປຣຕີນ interferon-inducible ທີ່ຄາດໄວ້ແລ້ວ, ພວກເຮົາຍັງໄດ້ລະບຸຕົວເຊື່ອມຕໍ່ລະຫວ່າງກັນລະຫວ່າງໂມເລກຸນ ແລະ intramolecular ຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ interferon-inducible canonical ເຊັ່ນ MX1, USP18, OAS3, ແລະ STAT1.ພວກເຮົາໄດ້ສຸມໃສ່ການກວດສອບຄວາມຖືກຕ້ອງຂອງ orthogonal ຂອງຊຸດ Novell ຂອງເຄືອຂ່າຍທາດໂປຼຕີນຈາກ interferon-inducible ທີ່ສ້າງຂຶ້ນໂດຍທາດໂປຼຕີນຈາກ HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) ໂດຍໃຊ້ co-immunoprecipitation ແລະການສຶກສາເພີ່ມເຕີມຂອງພວກເຂົາໂດຍໃຊ້ການສ້າງແບບຈໍາລອງການເຄື່ອນໄຫວໂມເລກຸນ.ການສ້າງແບບຈໍາລອງຂອງນະໂຍບາຍດ້ານການສອດຄ່ອງຂອງສະລັບສັບຊ້ອນທາດໂປຼຕີນໄດ້ເປີດເຜີຍສະຖານທີ່ປະຕິສໍາພັນຈໍານວນຫນຶ່ງທີ່ສະທ້ອນເຖິງປະຕິສໍາພັນທີ່ລະບຸໄວ້ໃນການຄົ້ນພົບ CLMS.ຮ່ວມກັນ, ພວກເຮົານໍາສະເຫນີການສຶກສາທົດລອງຂອງ CLMS ເພື່ອກໍານົດສະລັບສັບຊ້ອນສັນຍານໃຫມ່ induced ໂດຍ interferon, ແລະຫວັງວ່າຈະໄດ້ການນໍາໃຊ້ຢ່າງກວ້າງຂວາງຂອງ CLMS ເພື່ອກໍານົດນະໂຍບາຍດ້ານໃຫມ່ຂອງປະຕິສໍາພັນທາດໂປຼຕີນໃນ microenvironment tumor.
ກ່ອນທີ່ຈະເລີ່ມຕົ້ນການຕອບສະຫນອງພູມຕ້ານທານທີ່ປັບຕົວໄດ້, ລະບົບປ້ອງກັນພາຍໃນຂອງເຈົ້າພາບຕິດຕັ້ງການຕອບສະຫນອງຕ້ານເຊື້ອຈຸລິນຊີ mediated ໂດຍຄອບຄົວຂອງ cytokines alpha-helical ທີ່ລັບທີ່ເອີ້ນວ່າ interferons (IFNs).ປະເພດ I IFN classes IFNα ແລະ IFNβ ກະຕຸ້ນການຕອບສະຫນອງຂອງເຊນ, ລວມທັງການຕ້ານເຊື້ອໄວຣັສ, propoptotic, proinflammatory, ແລະລັດຕ້ານການແຜ່ກະຈາຍ.ໃນມະນຸດ, 13 ຊະນິດຍ່ອຍຂອງ IFNα ແມ່ນເປັນທີ່ຮູ້ຈັກ, ທັງຫມົດແມ່ນກຸ່ມຢູ່ໃນໂຄໂມໂຊມ 91. ເປັນເລື່ອງແປກທີ່, ພຽງແຕ່ IFNα2 ໄດ້ຖືກສຶກສາສໍາລັບການນໍາໃຊ້ທາງດ້ານການຊ່ວຍ.ບໍ່ດົນມານີ້, ຄວາມສົນໃຈພິເສດໄດ້ຖືກຈ່າຍໃຫ້ການຄົ້ນຄວ້າກ່ຽວກັບປະເພດຍ່ອຍອື່ນໆຂອງ IFNα.ການສຶກສາທີ່ຜ່ານມາໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ IFNα14 ແມ່ນຫນຶ່ງໃນ isoforms ທີ່ມີປະສິດທິພາບທີ່ສຸດໃນການຈໍາກັດການຈໍາລອງ HBV2 ແລະ HIV-13,4 ເມື່ອທຽບກັບ canonical IFNα2 subtype.
ມັນໄດ້ຖືກສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນວ່າປະເພດ I activated interferon receptor complexes (IFNAR1 ແລະ IFNAR2) ເຮັດໃຫ້ເກີດການສົ່ງສັນຍານ cascade mediated ໂດຍ Janus kinases TYK2 ແລະ JAK15,6.ເຫຼົ່ານີ້ Janus kinases phosphorylate signal transducers ແລະ transcriptional protein activators (STAT1 ແລະ STAT2) ກ່ຽວກັບ residues tyrosine ເພື່ອລິເລີ່ມ SH2 domain-mediated heterodimerization6.ຕໍ່ມາ, IRF9 ຜູກມັດ STAT heterodimers ເພື່ອສ້າງເປັນສະລັບສັບຊ້ອນ trimeric ຂອງ IFN-stimulated factor 3 gene (ISGF3), ເຊິ່ງ translocates ກັບ nucleus ແລະ induces transcription of over 2000 interferon-stimulated genes (ISGs)5,6,7,8.
ISGs ປະກອບເປັນກະດູກສັນຫຼັງຂອງລະບົບພູມຕ້ານທານພາຍໃນ, ໂດຍສະເພາະໃນການຕອບສະຫນອງຕໍ່ການໂຈມຕີໄວຣັດ.ໃນຖານະເປັນສາຍປ້ອງກັນທໍາອິດຂອງການຕິດເຊື້ອໄວຣັດ, ຈຸລັງປະຕິບັດປະຕິສໍາພັນຂອງໂປຣຕີນຂອງຈຸລັງຢ່າງໄວວາກັບກິດຈະກໍາທາງຊີວະພາບທີ່ກວ້າງຂວາງ.ທາດໂປຼຕີນເຫຼົ່ານີ້ປະກອບມີຕົວຮັບການຮັບຮູ້ຮູບແບບ, ໂມເລກຸນສັນຍານ, ປັດໃຈການຖ່າຍທອດ, ແລະໂປຣຕີນທີ່ມີຫນ້າທີ່ຕ້ານໄວຣັດໂດຍກົງ, ເຊັ່ນດຽວກັນກັບຕົວຄວບຄຸມທາງລົບຂອງການຕອບສະຫນອງພູມຕ້ານທານ9.ຂໍ້ມູນຫຼາຍຢ່າງກ່ຽວກັບກິດຈະກໍາ ISG ແມ່ນມາຈາກຫນ້າຈໍທີ່ມີປະໂຫຍດໂດຍໃຊ້ overexpression screens10,11 ຫຼືເຕັກນິກການງຽບຂອງ gene (siRNA, RNAi ແລະ CRISPR)12,13 ທີ່ ISGs ແຕ່ລະຄົນສະແດງອອກຫຼືຖືກຍັບຍັ້ງແລະກິດຈະກໍາຂອງພວກມັນຖືກທົດສອບໃນໄວຣັສຕ່າງໆ.ເຖິງແມ່ນວ່າການສຶກສາເຫຼົ່ານີ້ໄດ້ກໍານົດຄຸນສົມບັດຕ້ານເຊື້ອໄວຣັສຂອງ ISGs ສ່ວນບຸກຄົນ, ກົນໄກໂມເລກຸນທີ່ຕິດພັນຂອງແຕ່ລະ ISG ຍັງບໍ່ຮູ້ຈັກ.ມັນໄດ້ຖືກຍອມຮັບໂດຍທົ່ວໄປວ່າທາດໂປຼຕີນຫຼາຍປະຕິສໍາພັນກັບຫນຶ່ງຫຼືຫຼາຍ cytokines ເພື່ອຮັບປະກັນກິດຈະກໍາຢ່າງເຕັມທີ່, ດັ່ງນັ້ນ ISGs ໂຕ້ຕອບໂດຍກົງຫຼືປະຕິສໍາພັນຂອງພວກມັນຖືກໄກ່ເກ່ຍໂດຍທາດໂປຼຕີນຈາກເຊນ.ສໍາລັບຕົວຢ່າງ, ການສຶກສາ proteomics photocrosslinked ທີ່ຜ່ານມາໄດ້ກໍານົດ ATPase VCP/p97 ເປັນຄູ່ຮ່ວມງານປະຕິສໍາພັນ IFITM3 ທີ່ສໍາຄັນ, ຊຶ່ງການຍັບຍັ້ງນໍາໄປສູ່ຄວາມບົກຜ່ອງໃນການຈັດລຽງ lysosomal, ການປ່ຽນແປງ, ແລະ cotransport ຂອງ IFITM3 ກັບ particles viral 14 .ການນໍາໃຊ້ immunoprecipitation, ພວກເຮົາໄດ້ກໍານົດ VAPA, ທາດໂປຼຕີນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ vesicle, ເປັນຄູ່ຮ່ວມງານປະຕິສໍາພັນກັບ IFITM1/2/3 ທີ່ໄກ່ເກ່ຍ cholesterol-mediated viral maturation, ແລະນີ້ໄດ້ຖືກຢືນຢັນໂດຍການສຶກສາອື່ນໂດຍໃຊ້ລະບົບປະສົມສອງເຊື້ອລາ.ສະຫນັບສະຫນູນວິທະຍາສາດ 15 , 16 .
ຂະບວນການທາງຊີວະພາບພື້ນຖານທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການສະກັດກັ້ນການຕິດເຊື້ອແລະການຫັນເປັນ malignant ແມ່ນການນໍາສະເຫນີ antigen, ເຊິ່ງໄກ່ເກ່ຍໂດຍໂມເລກຸນ histocompatibility complex (MHC) ທີ່ສໍາຄັນ.Peptides (8-12 ອາຊິດ amino ຍາວ) ຈາກ cleaved, terminated ກ່ອນໄວອັນຄວນຫຼື misfolded ທາດໂປຼຕີນແມ່ນ loaded ເຂົ້າໄປໃນ heterodimer MHC-I (ປະກອບດ້ວຍຕ່ອງໂສ້ຫນັກ MHC-I ແລະແສງສະຫວ່າງ, ເອີ້ນວ່າ β-2-microglobulin; β2M) 17,18 .ເຄື່ອງຕັດ MHC-I ທີ່ຄົງທີ່ທີ່ເປັນຜົນມາຈາກການຖືກຂົນສົ່ງໄປຫາຫນ້າເຊລ, ບ່ອນທີ່ພວກມັນນໍາສະເຫນີ peptides intracellular ກັບ CD8+ T cells (cytotoxic T cells)17.ຈຸລັງ T ຮັບຮູ້ແລະທໍາລາຍເຊື້ອພະຍາດເຫຼົ່ານີ້ແລະຈຸລັງທີ່ມີ antigen ສະເພາະ tumor.ດັ່ງນັ້ນ, ເຊື້ອພະຍາດແລະຈຸລັງ tumor ມັກຈະສະກັດກັ້ນຂະບວນການນໍາສະເຫນີ antigen ເພື່ອຫຼີກເວັ້ນການເຝົ້າລະວັງ.ນອກຈາກນັ້ນ, MHC-I ໄດ້ຖືກຫຼຸດລົງໃນ 40-90% ຂອງເນື້ອງອກຂອງມະນຸດແລະມັກຈະກ່ຽວຂ້ອງກັບການຄາດຄະເນທີ່ບໍ່ດີກວ່າ 19.
ພັນທຸ ກຳ ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການຕອບສະ ໜອງ ຕໍ່ເຊື້ອພະຍາດຕ້ອງປ່ຽນຢ່າງໄວວາລະຫວ່າງສະຖານະຂອງການພັກຜ່ອນແລະສະຖານະຂອງການຖ່າຍທອດການເຄື່ອນໄຫວ.ດັ່ງນັ້ນ, ທາດໂປຼຕີນຈາກຈຸລັງຈໍານວນຫນຶ່ງໄດ້ຖືກສົມມຸດຕິຖານທີ່ຈະມີສ່ວນຮ່ວມໃນການຕອບສະຫນອງຕໍ່ຄວາມຕ້ອງການ IFN ສູງໃນໄລຍະເວລາສັ້ນໆ, ລວມທັງການປັບປຸງແລະການດັດແປງຂອງ promotin chromatin 20,21.ການສຶກສາສ່ວນໃຫຍ່ໄດ້ສຸມໃສ່ການກໍານົດຄູ່ຮ່ວມງານຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ ISG ສ່ວນບຸກຄົນໃນການປະກົດຕົວຂອງ IFN.ການສຶກສາ proteomic ແລະ transcriptomic ຫຼາຍໆຄັ້ງໃນລະບົບຈຸລັງແບບຈໍາລອງໄດ້ອະທິບາຍຜົນກະທົບຂອງ IFN ໃນພູມສັນຖານຂອງເຊນ.ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ເຖິງວ່າຈະມີຄວາມເຂົ້າໃຈເພີ່ມຂຶ້ນກ່ຽວກັບການເຄື່ອນໄຫວທີ່ກະຕຸ້ນໂດຍ interferons, ພວກເຮົາຍັງຮູ້ຫນ້ອຍກ່ຽວກັບການມີສ່ວນຮ່ວມຂອງ ISGs.ເມື່ອພິຈາລະນາຄວາມຊັບຊ້ອນແລະການເຄື່ອນໄຫວຕາມເວລາຂອງການສົ່ງສັນຍານ interferon, ສອງຄໍາຖາມເກີດຂື້ນ: (i) ມັນເປັນໄປໄດ້ທີ່ຈະສະຖຽນລະພາບແລະດັກຊັບຊ້ອນ multiprotein ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບສັນຍານໄວ, ແລະ (ii) ການໂຕ້ຕອບເຫຼົ່ານີ້ສາມາດສ້າງແຜນທີ່ຢູ່ໃນຊ່ອງ 3D ໄດ້ບໍ?
ເພື່ອແກ້ໄຂບັນຫາເຫຼົ່ານີ້, ພວກເຮົາໄດ້ປະຕິບັດ disuccinimide suberate-mediated chemical cross-linking (DSS) ບວກໃສ່ກັບ mass spectrometry (CLMS) ເພື່ອສຶກສາເຄືອຂ່າຍປະຕິສໍາພັນທາດໂປຼຕີນຈາກ IFNα-induced ແລະນະໂຍບາຍດ້ານຂອງມັນ.DSS ເພີ່ມພັນທະບັດ covalent ລະຫວ່າງສ່ວນທີ່ເຫຼືອຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ໃກ້ຄຽງແລະ / ຫຼືສະລັບສັບຊ້ອນຂອງທາດໂປຼຕີນໃນ vivo.ການວິເຄາະ MS ຕໍ່ມາເປີດເຜີຍໃຫ້ເຫັນສະຖານທີ່ crosslinking ສະເພາະທີ່ສະທ້ອນໃຫ້ເຫັນເຖິງຄວາມໃກ້ຊິດທາງກວ້າງຂອງພາກພື້ນພາຍໃນທາດໂປຼຕີນໂດຍສະເພາະ, ເອີ້ນວ່າການເຊື່ອມຕໍ່ພາຍໃນ, ຫຼື subunits ໃນສະລັບສັບຊ້ອນທາດໂປຼຕີນ, ເອີ້ນວ່າ interrelationships.ການນໍາໃຊ້ວິທີການນີ້, ພວກເຮົາໄດ້ກໍານົດສະລັບສັບຊ້ອນທາດໂປຼຕີນ - ທາດໂປຼຕີນທີ່ໃຫມ່ເຊັ່ນດຽວກັນກັບເຄືອຂ່າຍປະຕິສໍາພັນ multiprotein ທີ່ກະຕຸ້ນ interferon.ໂດຍການທົດສອບເພີ່ມເຕີມສ່ວນຍ່ອຍຂອງການໂຕ້ຕອບໃຫມ່ເຫຼົ່ານີ້, ພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ H2BFS (H2B histone-type FS; ຕໍ່ໄປນີ້ເອີ້ນວ່າ H2B) ແລະ MDN1 ເຮັດຫນ້າທີ່ເປັນຄູ່ຮ່ວມງານຜູກມັດສໍາລັບ HLA-A.
ຈຸລັງ Flo-1 ແມ່ນຫນຶ່ງໃນຕົວແບບທີ່ຮູ້ຈັກດີທີ່ສຸດໃນ vitro ຂອງ adenocarcinoma esophageal ຍ້ອນວ່າພວກມັນ mimic ລັກສະນະທີ່ສໍາຄັນຂອງ tumors esophageal22,23.ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ບໍ່ແມ່ນເນື້ອງອກທັງຫມົດແມ່ນ immunogenic, ແລະເພື່ອກໍານົດວ່າຈຸລັງ Flo-1 ຕອບສະຫນອງກັບການປິ່ນປົວ interferon, ພວກເຮົາໄດ້ປິ່ນປົວຈຸລັງ Flo-1 ດ້ວຍ 10 ng / ml IFNα ເປັນເວລາ 72 ຊົ່ວໂມງ.ຈຸລັງ Flo-1 ສະແດງໃຫ້ເຫັນການກະຕຸ້ນເບື້ອງຕົ້ນຂອງ pSTAT1 ແລະ IRF1, ເລີ່ມຕົ້ນ 2 ຊົ່ວໂມງຫຼັງຈາກການປິ່ນປົວແລະສືບຕໍ່ເປັນເວລາ 72 ຊົ່ວໂມງ, ໂດຍມີການຫຼຸດລົງຕາມເວລາຂອງລະດັບ stationary ຂອງ IRF1 (ຮູບ 1A).ISGs (MX1, IFITM1, OAS1/2, ແລະ ISG15) ໄດ້ຖືກພົບເຫັນວ່າໄດ້ຮັບການກະຕຸ້ນຢ່າງແຂງແຮງຫຼັງຈາກ 6 ຊົ່ວໂມງ, ການເຮັດແບບຈໍາລອງການຕອບສະຫນອງໄລຍະກາງແລະທ້າຍຄລາສສິກກັບ IFNα (ຮູບ 1A).ຮ່ວມກັນ, ຂໍ້ມູນເຫຼົ່ານີ້ແນະນໍາວ່າຮູບແບບໂທລະສັບມືຖືນີ້ສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອສຶກສາການຕອບສະຫນອງຂອງ interferon.
ຄວາມແຕກຕ່າງຂອງການສະແດງອອກຂອງທາດໂປຼຕີນໃນຈຸລັງ Flo-1 ຫຼັງຈາກການປິ່ນປົວ IFNα.(A) ການສະແດງອອກຂອງທາດໂປຼຕີນໃນຈຸລັງ Flo-1 ທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ 10 ng/ml IFNα ເປັນເວລາ 2, 6, 24, 48 ແລະ 72 ຊົ່ວໂມງໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍ immunoblot ໂດຍໃຊ້ພູມຕ້ານທານ ISG ທີ່ລະບຸໄວ້.(B) Coomassie blue stained SDS-PAGE gels ຂອງສານສະກັດຈາກເຊນທັງຫມົດຫຼັງຈາກການເຊື່ອມຕໍ່ຂ້າມກັບ DSS ສໍາລັບເວລາແລະຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນທີ່ລະບຸໄວ້.(C) ຕົວແທນ immunoblot ກວດດ້ວຍພູມຕ້ານທານ p53(DO-1) ຈາກຕົວຢ່າງດຽວກັນເພື່ອປະເມີນລະດັບການເຊື່ອມໂຍງລະຫວ່າງທາດໂປຼຕີນ.
ເພື່ອບັນທຶກພູມສັນຖານປະຕິສໍາພັນຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກສະຖານທີ່, ພວກເຮົາໄດ້ນໍາໃຊ້ DSS, ຕົວແທນການເຊື່ອມໂຍງຂ້າມທີ່ໃຊ້ກັນຢ່າງກວ້າງຂວາງເນື່ອງຈາກການ permeability ຂອງເຍື່ອສູງແລະເວລາຕິກິຣິຍາຂ້ອນຂ້າງສັ້ນ.ໄລຍະເວລາປະຕິກິລິຢາທີ່ສັ້ນກວ່າຈະຊ່ວຍປ້ອງກັນບໍ່ໃຫ້ເກີດການລວມຕົວຂະຫນາດໃຫຍ່ຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ crosslinker, ດັ່ງນັ້ນການຮັກສາຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງ crosslinker.ເພື່ອກໍານົດຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ DSS ທີ່ດີທີ່ສຸດແລະຫຼີກເວັ້ນການ over-crosslinking, ພວກເຮົາທໍາອິດເປີດເຜີຍຈຸລັງກັບ 5, 2.5, ແລະ 1 mM DSS ສໍາລັບ 5, 10, 5, ແລະ 30 ນາທີ, ຕາມລໍາດັບ, ແລະວິເຄາະ lysates ໂດຍ Coomassie-stained SDS-PAGE (ບໍ່ສະແດງຂໍ້ມູນ).lysates ຈຸລັງປະກົດວ່າມີການເຊື່ອມໂຍງກັນຫຼາຍໃນລະດັບຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຕ່ໍາສຸດແລະຢູ່ໃນຈຸດທີ່ໃຊ້ເວລາສັ້ນທີ່ສຸດ.ດັ່ງນັ້ນ, DSS ໄດ້ຖືກ titrated ເປັນ 1, 0.5, ແລະ 0.1 mM ໃນໄລຍະ 5 ນາທີ (ຮູບ 1B).ການເຊື່ອມໂຍງຂ້າມທີ່ດີທີ່ສຸດໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນດ້ວຍ 0.5 mM DSS ສໍາລັບ 5 ນາທີ, ແລະເງື່ອນໄຂເຫຼົ່ານີ້ຖືກເລືອກສໍາລັບຈຸລັງທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ IFNα.ນອກຈາກນັ້ນ, ຮູບ 1C ສະແດງໃຫ້ເຫັນ blot ຕາເວັນຕົກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ p53 (DO-1) ພູມຕ້ານທານເພື່ອປະເມີນລະດັບຂອງການເຊື່ອມໂຍງລະຫວ່າງທາດໂປຼຕີນ.
ຈຸລັງ Flo-1 ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ IFNα 10 ng/ml ເປັນເວລາ 24 ຊົ່ວໂມງກ່ອນທີ່ຈະເພີ່ມ crosslinker.ຈຸລັງຂ້າມເຊື່ອມຕໍ່ໄດ້ຖືກ lysed ຕໍ່ມາໂດຍ proteolysis ສອງຂັ້ນຕອນແລະທາດໂປຼຕີນໄດ້ຖືກປຸງແຕ່ງໂດຍ FASP (ຮູບ 2) 24,25.peptides tryptic ຂ້າມເຊື່ອມຕໍ່ໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍ spectrometry ມະຫາຊົນ (ຮູບ 2).ຈາກນັ້ນ MS/MS spectra ຖືກຈັບຄູ່ກັບລໍາດັບທາດໂປຼຕີນ ແລະໃຫ້ປະລິມານດ້ວຍ MaxQuant26,27.peptides ຂ້າມເຊື່ອມຕໍ່ໄດ້ຖືກລະບຸຈາກ spectra ທີ່ໄດ້ຮັບໂດຍໃຊ້ໂຄງການ SIM-XL, ແລະທາດປະສົມສ່ວນບຸກຄົນໄດ້ຖືກລວມເຂົ້າກັນເປັນເຄືອຂ່າຍສະລັບສັບຊ້ອນໂດຍໃຊ້ທໍ່ຊອບແວຄອມພິວເຕີ້ເປີດ xQuest28 ແລະ SIM-XL29 (ຮູບ 2).SIM-XL ກໍານົດປະຕິສໍາພັນຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກທາດໂປຼຕີນ, ຕ່ອງໂສ້ພາຍໃນແລະລະບົບຕ່ອງໂສ້ສ່ວນບຸກຄົນໃນການປະສົມທາດໂປຼຕີນທີ່ງ່າຍດາຍຫຼືສະລັບສັບຊ້ອນແລະສະຫນອງສະຄິບສໍາລັບການເບິ່ງເຫັນປະຕິສໍາພັນໃນໂຄງສ້າງທາດໂປຼຕີນ.ນອກຈາກນັ້ນ, ມັນຈັດອັນດັບແຕ່ລະການອ້າງອິງຂ້າມເປັນຄະແນນ ID ຕາມຄຸນນະພາບ MS/MS29.ປະຕິສໍາພັນຂອງທາດໂປຼຕີນແລະທາດໂປຼຕີນທີ່ມີຄວາມຫນ້າເຊື່ອຖືສູງຈໍານວນຫນຶ່ງໄດ້ຖືກລະບຸໄວ້, ແລະຊຸດປະຕິສໍາພັນໃຫມ່ໄດ້ຖືກສືບສວນຕື່ມອີກໂດຍໃຊ້ການຮ່ວມ immunoprecipitation ແລະການປ່ຽນແປງທີ່ສອດຄ່ອງຂອງສະລັບສັບຊ້ອນໂດຍໃຊ້ແບບຈໍາລອງການເຄື່ອນໄຫວໂມເລກຸນ (MD) (ຮູບ 2) 30, 31.
ພາບລວມແບບແຜນຂອງວິທີການ CLMS.ຈຸລັງ Flo-1 ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ IFNα 10 ng/ml ເປັນເວລາ 24 ຊົ່ວໂມງຕາມດ້ວຍການເຊື່ອມໂຍງຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ in situ ໂດຍໃຊ້ DSS ຕິດຕາມດ້ວຍ lysis ຈຸລັງແລະ trypsinization.ຕົວຢ່າງຂ້າມເຊື່ອມຕໍ່ໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍໃຊ້ Orbitrap mass spectrometer ແລະຕົວຢ່າງເພີ່ມເຕີມສໍາລັບການ fragmentation ຂອງ peptide precursors ໃນໄລຍະ LC-MS / MS.ສອງ peptides ເຊື່ອມຕໍ່ໄດ້ຖືກລະບຸຈາກ spectra ທີ່ໄດ້ຮັບໂດຍໃຊ້ Spectrum Recognition Machine ຂອງໂຄງການ Crosslinked Peptides (SIM-XL), ແລະທາດປະສົມທັງຫມົດໄດ້ຖືກລວມເຂົ້າກັນເປັນເຄືອຂ່າຍສະລັບສັບຊ້ອນໂດຍໃຊ້ທໍ່ຄອມພິວເຕີ້.ກັ່ນ​ຕອງ​ການ​ໂຕ້​ຕອບ​ຄວາມ​ຫມັ້ນ​ໃຈ​ຕ​່​ໍ​າ​ໂດຍ​ອີງ​ໃສ່​ຄະ​ແນນ​ອັດ​ຕາ​ທາງ​ບວກ​ທີ່​ບໍ່​ຖືກ​ຕ້ອງ (FDR​)​.ປະຕິສໍາພັນຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ມີຄວາມສັດຊື່ສູງໃຫມ່ຈໍານວນຫນຶ່ງໄດ້ຖືກຢືນຢັນຕື່ມອີກໂດຍໃຊ້ immunoprecipitation ຮ່ວມກັນ, ແລະການປ່ຽນແປງທີ່ສອດຄ່ອງໃນສະລັບສັບຊ້ອນໄດ້ຖືກກວດສອບໂດຍໃຊ້ການສ້າງແບບຈໍາລອງຂອງໂມເລກຸນ (MD).
ຈໍານວນທັງຫມົດຂອງ ~ 30,500 ແລະ ~ 28,500 peptides ຖືກກວດພົບໂດຍໃຊ້ MaxQuant ໃນຕົວຢ່າງ IFNα ທີ່ບໍ່ກະຕຸ້ນແລະກະຕຸ້ນ, ຕາມລໍາດັບ (ຕາຕະລາງເສີມ S1, ຮູບ 3A).ການແຜ່ກະຈາຍຄວາມຍາວຂອງ peptide ໃນທັງສອງກໍລະນີໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນອັດຕາສ່ວນທີ່ສູງຂຶ້ນຂອງ peptides ຂະຫນາດໃຫຍ່, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງການມີ peptides ຂ້າມເຊື່ອມຕໍ່ (ຮູບ 3B, C).ນອກຈາກນັ້ນ, ອັດຕາສ່ວນຂອງ peptides ທີ່ໃຫຍ່ກວ່າແມ່ນມີຢູ່ໃນຂອບເຂດ 40-55 ໃນຕົວຢ່າງທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ IFNα (ຮູບ 3C).ການສ້າງແຜນທີ່ຂອງທາດໂປຼຕີນຕໍ່ກັບຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ log2 ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າທາດໂປຼຕີນທີ່ຖືກກະຕຸ້ນຈາກ interferon ຄລາສສິກແມ່ນອຸດົມສົມບູນທີ່ສຸດເມື່ອທຽບກັບຕົວຢ່າງທີ່ບໍ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວ, ລວມທັງ MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58, ແລະ HLA-F (ຮູບ 3D).ການວິເຄາະເສັ້ນທາງສໍາລັບທາດໂປຼຕີນຫຼາຍກວ່າສາມເທົ່າທີ່ອຸດົມສົມບູນໃນການຕອບສະຫນອງຕໍ່ການປິ່ນປົວ IFNα ໂດຍໃຊ້ຖານຂໍ້ມູນເສັ້ນທາງ Reactome ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການນໍາສະເຫນີແລະການປຸງແຕ່ງ antigen MHC-I-mediated ແມ່ນເສັ້ນທາງທີ່ໂດດເດັ່ນທີ່ສຸດ (ຮູບ 3E).ສອດຄ່ອງກັບບົດລາຍງານກ່ອນຫນ້າ, ການຕອບໂຕ້ຕ້ານໄວຣັດທີ່ໄກ່ເກ່ຍໂດຍ OAS ແລະ ISG15 ເຊັ່ນດຽວກັນກັບສັນຍານ IFNα/β ແລະ cytokine ແມ່ນຢູ່ໃນບັນດາເສັ້ນທາງທີ່ຖືກເປີດໃຊ້.ນອກຈາກນັ້ນ, ການເຊື່ອມຕໍ່ຂ້າມຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ lysine ແລະ serine ສະເພາະແມ່ນໄດ້ຖືກກໍານົດຈາກ MS / MS spectra ທີ່ໄດ້ມາໃນເບື້ອງຕົ້ນໂດຍໃຊ້ SIM-XL.ການສຶກສາທີ່ຜ່ານມາໄດ້ລາຍງານ 104 ISGs ກວມເອົາ 20 ໄວຣັສຈາກ 9 ຫ້ອງຮຽນໄວຣັສໂດຍການວິເຄາະ meta ຂອງການສຶກສາການສະແດງອອກຂອງ ISG ສ່ວນບຸກຄົນໃນ 5 ປະເພດຈຸລັງ9.ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ເພື່ອເອົາຊະນະຂໍ້ຈໍາກັດທາງຄອມພິວເຕີ້ຂອງການກວດສອບຊຸດຂໍ້ມູນຂະຫນາດໃຫຍ່, ພວກເຮົາໄດ້ເລີ່ມຕົ້ນດ້ວຍຊຸດຂໍ້ມູນຂະຫນາດນ້ອຍກວ່າເພື່ອຄົ້ນຫາການໂຕ້ຕອບທີ່ເປັນໄປໄດ້ລະຫວ່າງບັນຊີລາຍຊື່ຂອງ IRDS ທີ່ລາຍງານໂດຍ Padaria et al., ເຊິ່ງສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນ ISGs.
ການກໍານົດຄວາມແຕກຕ່າງຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ຂ້າມທີ່ສະແດງອອກໂດຍຕອບສະຫນອງຕໍ່ IFNα (ຂໍ້ມູນທີ່ໄດ້ຮັບຈາກ MaxQuant).(A) ແຜນວາດ Venn ແທນຈໍານວນຂອງ peptides ທົ່ວໄປແລະສະເພາະທີ່ລະບຸໄວ້ໃນ IFNα14 ຕົວຢ່າງ Flo-1 ທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວແລະບໍ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວ.ການແຜ່ກະຈາຍຄວາມຍາວຂອງ Peptide ຂອງຕົວຢ່າງທີ່ບໍ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວ (B) ແລະ IFNα ທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວ (C) ແບບຂ້າມເຊື່ອມຕໍ່.(D) ແຜນທີ່ຄວາມຮ້ອນທີ່ເປັນຕົວແທນຂອງ log2 (ຄວາມເຂັ້ມຂອງ LFQ) ລະຫວ່າງຈຸລັງ Flo-1 ທີ່ບໍ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວແລະ IFNα14.ແຜງດ້ານຊ້າຍສະແດງໃຫ້ເຫັນທາດໂປຼຕີນທີ່ຖືກກະຕຸ້ນຫຼາຍທີ່ສຸດຢູ່ໃນທີ່ປະທັບຂອງ IFNα.(E) Histogram ເປັນຕົວແທນຂອງ 20 ເສັ້ນທາງການເສີມສ້າງທີ່ສໍາຄັນຫຼັງຈາກການປິ່ນປົວIFNα.ຖານຂໍ້ມູນເສັ້ນທາງ Reactome ໄດ້ວິເຄາະການປ່ຽນແປງຫຼາຍກ່ວາສີ່ເທົ່າຂອງໂປຣຕີນທີ່ຕອບສະຫນອງ IFNα ທີ່ຖືກຄວບຄຸມ.
ການກະຕຸ້ນຂອງ Interferon-mediated ISG ໄດ້ຖືກບັນທຶກໄວ້ຢ່າງດີ, ແຕ່ໃນລະດັບໂມເລກຸນມັນເຂົ້າໃຈບໍ່ດີວ່າໂປຣຕີນເຫຼົ່ານີ້ມີຫນ້າທີ່ທາງດ້ານຊີວະວິທະຍາຢ່າງກວ້າງຂວາງແນວໃດ.ພວກເຮົາໄດ້ສືບສວນການໂຕ້ຕອບຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ມີລະດັບຄວາມຫມັ້ນໃຈສູງລະຫວ່າງ ISGs ທີ່ຮູ້ຈັກ.ຫນ້າສົນໃຈ, ພວກເຮົາໄດ້ກໍານົດເຄືອຂ່າຍລວມທັງ MX1, USP18, ROBO1, OAS3, ແລະ STAT1 ທາດໂປຼຕີນທີ່ປະກອບເປັນສະລັບສັບຊ້ອນຂະຫນາດໃຫຍ່ໃນການຕອບສະຫນອງຕໍ່ການປິ່ນປົວ IFNα (ຮູບ 4, ຕາຕະລາງ S2) 32,33,34.ສໍາຄັນທີ່ສຸດ, ປະຕິສໍາພັນເຫຼົ່ານີ້ໄດ້ຖືກພົບເຫັນຢູ່ໃນ triplicates ທັງຫມົດທີ່ປິ່ນປົວດ້ວຍ IFNα ແລະບໍ່ພົບຢູ່ໃນຕົວຢ່າງທີ່ບໍ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວ, ແນະນໍາວ່າພວກມັນຖືກສ້າງຕັ້ງຂື້ນໂດຍສະເພາະເພື່ອຕອບສະຫນອງການປິ່ນປົວ IFNα.ມັນເປັນທີ່ຮູ້ຈັກວ່າ STAT1 transcriptionally ຄວບຄຸມການສະແດງອອກຂອງ ISGs ເຫຼົ່ານີ້, ແຕ່ປະຕິສໍາພັນຂອງມັນກັບ ISGs ໃນລະດັບທາດໂປຼຕີນຍັງບໍ່ທັນໄດ້ສຶກສາ.ໂຄງສ້າງຜລຶກຂອງ STAT1 ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າໂດເມນ helical ຂອງມັນ (CCD) ບໍ່ໄດ້ມີສ່ວນຮ່ວມໃນການໂຕ້ຕອບກັບ DNA ຫຼື protomers ໃນລະຫວ່າງການສ້າງຕັ້ງຂອງ dimers35.α-helices ເຫຼົ່ານີ້ປະກອບເປັນໂຄງສ້າງ helix helical ທີ່ສະຫນອງພື້ນທີ່ນ້ໍາທີ່ມີນ້ໍາສ່ວນໃຫຍ່ສໍາລັບການໂຕ້ຕອບທີ່ຈະເກີດຂຶ້ນ 35 .ໃນຂໍ້ມູນ CLMS ຂອງພວກເຮົາ, ພວກເຮົາສັງເກດເຫັນວ່າການໂຕ້ຕອບກັບ STAT1 ສ່ວນໃຫຍ່ເກີດຂຶ້ນໃນໂດເມນ SH2 ກ່ອນ CCD, ໂດເມນເຊື່ອມຕໍ່, ຫຼືຫາງ C-terminal ( residues 700-708) (ຮູບ 4A).ການສຶກສາທີ່ຜ່ານມາໄດ້ລາຍງານວ່າ USP18 ຜູກມັດກັບ CCD ແລະ DNA-binding domain (DBD) ຂອງ STAT2 ແລະຖືກບັນຈຸເຂົ້າໃນ subunit ຂອງປະເພດ I interferon receptor IFNAR2 ເພື່ອໄກ່ເກ່ຍ inhibition ຂອງສັນຍານ interferon ປະເພດ I 24 .ຂໍ້ມູນຂອງພວກເຮົາຍັງໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າໂດເມນ catalytic USP18 ພົວພັນກັບ STAT1 DBD (ຮູບ 4A, D), ແນະນໍາວ່າທັງ STAT1 ແລະ STAT2 ອາດຈະມີບົດບາດໃນການດຶງດູດ USP18 ກັບ IFNAR2.
ເຄືອຂ່າຍ ISG ທາດໂປຼຕີນຈາກທາດໂປຼຕີນທີ່ຖືກກໍານົດຢູ່ໃນຈຸລັງຂ້າມເຊື່ອມຕໍ່ທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ IFNα.(A) ແຜນຜັງປະຕິສໍາພັນ 2D ສະແດງໃຫ້ເຫັນປະຕິສໍາພັນຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກທາດໂປຼຕີນ (ທີ່ສ້າງຂຶ້ນໃນໂຄງການ SIM-XL), ມີສາຍທີ່ເປັນຕົວແທນຂອງປະຕິສໍາພັນລະຫວ່າງໂມເລກຸນ (ຕັດການເຊື່ອມຕໍ່ຂ້າມກໍານົດເປັນ 3.5).ໂດເມນຂອງຕົວຕົນທີ່ແຕກຕ່າງກັນຖືກໝາຍດ້ວຍ color32: ໂດເມນ MX1, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547), ແລະ GED (569–660).ໂດເມນ OAS3: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), ແລະ OAS1_C (903-108).Domain ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) ແລະ fn3 (777–864).ຊ່ອງຂໍ້ມູນ STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), ແລະ STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Circular viewer ຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກການເຊື່ອມໂຍງຂ້າມ (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1, ແລະ STAT1) ທີ່ມີການໂຕ້ຕອບແລະການໂຕ້ຕອບທີ່ມີປ້າຍຊື່ສີຟ້າແລະສີແດງ, ຕາມລໍາດັບ.ເກນຂ້າມເຊື່ອມຕໍ່ຖືກຕັ້ງຢູ່ທີ່ 3.5.ແຜນຜັງຈຸດຊີ້ໃຫ້ເຫັນສະຖານທີ່ປະຕິສໍາພັນ STAT1 ກັບ MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E), ແລະ OAS3 (F), ເຊັ່ນດຽວກັນກັບສະຖານທີ່ປະຕິສໍາພັນ K ຫຼື S ລະຫວ່າງສອງ peptides.ໃນຮູບ, ຂອບເຂດຄະແນນການເຊື່ອມຕໍ່ຂ້າມແມ່ນຖືກກໍານົດເປັນ 3.0.(G) ສະຖານທີ່ປະຕິສໍາພັນຕ່າງໆລະຫວ່າງໂດເມນ STAT1 ແລະ OAS3 DI superimposed ກ່ຽວກັບໂຄງສ້າງທາດໂປຼຕີນຂອງພວກເຂົາໃນ PyMol (ລະບົບກາຟິກໂມເລກຸນ PyMOL, ຮຸ່ນ 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) ແລະ OAS3 (pdb id: 4s3n34).) ໂຄງ​ການ​.
ສອງ isoforms ຂອງ USP18 ໄດ້ຖືກອະທິບາຍຢູ່ໃນມະນຸດ, ເປັນທາດໂປຼຕີນທີ່ມີຄວາມຍາວເຕັມທີ່ຕັ້ງຢູ່ໃນແກນ, ແລະ isoform ທີ່ບໍ່ມີ N-terminal domain, USP18-sf, ເຊິ່ງຖືກແຈກຢາຍຢ່າງເທົ່າທຽມກັນໃນ cytoplasm ແລະ nucleus 36 .ນອກຈາກນັ້ນ, N-terminus ໄດ້ຖືກຄາດຄະເນວ່າບໍ່ມີໂຄງສ້າງແລະບໍ່ຮຽກຮ້ອງໃຫ້ມີກິດຈະກໍາ isopeptidase ຫຼື ISG1537 binding.ປະຕິສໍາພັນສ່ວນໃຫຍ່ທີ່ໄດ້ລະບຸໄວ້ໃນການສຶກສາຂອງພວກເຮົາແມ່ນຕັ້ງຢູ່ຈຸດ N-terminus ຂອງທາດໂປຼຕີນ, ແນະນໍາວ່າປະຕິສໍາພັນເຫຼົ່ານີ້ກ່ຽວຂ້ອງກັບ USP18 ທີ່ມີຄວາມຍາວເຕັມ (ຮູບ 4A, D) ແລະດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງອາດຈະເກີດຂື້ນໃນແກນ.ຍິ່ງໄປກວ່ານັ້ນ, ຂໍ້ມູນຂອງພວກເຮົາຍັງຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ N-terminus ມີຄວາມຊ່ຽວຊານສໍາລັບການໂຕ້ຕອບຂອງທາດໂປຼຕີນກັບທາດໂປຼຕີນ.ສະຖານທີ່ຜູກມັດ IFNAR2 ຕັ້ງຢູ່ລະຫວ່າງ residues 312-368, ແລະທີ່ໂດດເດັ່ນ, ບໍ່ມີທາດໂປຼຕີນໃນສະລັບສັບຊ້ອນທີ່ຜູກມັດກັບພາກພື້ນນີ້ (ຮູບ 4A) 37,38 .ຂໍ້ມູນເຫຼົ່ານີ້ປະຕິບັດຮ່ວມກັນຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າໂດເມນຜູກມັດ IFNAR2 ແມ່ນໃຊ້ສະເພາະໂດຍໂປຣຕີນ receptor.ນອກຈາກນັ້ນ, ມີພຽງແຕ່ OAS3 ແລະ ROBO1 ເທົ່ານັ້ນທີ່ພົບວ່າມີຄວາມກ່ຽວຂ້ອງກັບໂດເມນທີ່ຂຶ້ນກັບ N-terminus ແລະ IFNAR2 binding site (ຮູບ 4A).
ROBO1 ເປັນຂອງ immunoglobulin (Ig) superfamily ຂອງໂມເລກຸນສັນຍານ transmembrane ແລະປະກອບດ້ວຍຫ້າໂດເມນ Ig ແລະສາມໂດເມນ fibronectin (Fn) ໃນເຂດ extracellular.ໂດເມນນອກເຊວລູລາເຫຼົ່ານີ້ຖືກຕິດຕາມດ້ວຍບໍລິເວນເຍື່ອຫຸ້ມເຊນທີ່ໃກ້ຄຽງ ແລະ helix transmembrane ດຽວ 39. ພາກພື້ນພາຍໃນເຊນທີ່ບໍ່ມີໂຄງສ້າງແມ່ນຕັ້ງຢູ່ຈຸດ C-terminus ແລະປະກອບດ້ວຍ motifs ລໍາດັບທີ່ຮັກສາໄວ້ເຊິ່ງໄກ່ເກ່ຍການຜູກມັດທາດໂປຼຕີນ effector39.ພາກພື້ນທີ່ຂະຫຍາຍຈາກອາຊິດ amino ~ 1100 ຫາ 1600 ສ່ວນຫຼາຍແມ່ນຜິດປົກກະຕິ.ພວກເຮົາພົບວ່າ MX1 ພົວພັນກັບ ROBO1 ຜ່ານ Ig, Fn, ແລະ intracellular domains, ໃນຂະນະທີ່ການໂຕ້ຕອບສ່ວນໃຫຍ່ກັບ STAT1 ເກີດຂື້ນລະຫວ່າງ CCD, linker domain ຂອງມັນແລະ C-terminus ຂອງ ROBO1 (ຮູບ 4A,E).ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ການໂຕ້ຕອບກັບພາກພື້ນເຊື່ອມຕໍ່ DI, DIII, ແລະ OAS3 ໄດ້ຖືກແຈກຢາຍໃນທົ່ວໂປຣຕີນ ROBO1 (ຮູບ 4A).
ຄອບຄົວໂປຣຕີນ oligoadenylate synthase (OAS) ຍອມຮັບແລະຜູກມັດ intracellular double-stranded RNA (dsRNA), ມີການປ່ຽນແປງທີ່ສອດຄ່ອງ, ແລະສັງເຄາະ 2′,5′-linked oligoadenylates (2-5 As) 40 .ມັນໄດ້ຖືກພົບເຫັນວ່າໃນບັນດາສາມ OASs, OAS3 ສະແດງໃຫ້ເຫັນຄວາມໃກ້ຊິດທີ່ສູງທີ່ສຸດສໍາລັບ dsRNA ແລະສັງເຄາະຫນ້ອຍສຸດຂອງ 2-5 As, ເຊິ່ງສາມາດກະຕຸ້ນ RNase L ແລະດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງຈໍາກັດການຈໍາລອງເຊື້ອໄວຣັສ 41 .ຄອບຄົວ OAS ປະກອບດ້ວຍໂດເມນໂພລີເມີເຣສເບຕ້າ (pol-β) ຄ້າຍກັບ ນິວຄລີໂອທີນ ໂອນເຣສເຊສ.ການຄົ້ນຄວ້າທີ່ຜ່ານມາໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າກິດຈະກໍາ catalytic ຂອງໂດເມນ C-terminal (DIII) ແມ່ນຂຶ້ນກັບໂດເມນ dsRNA-binding (DI), ເຊິ່ງຕ້ອງການສໍາລັບການເປີດໃຊ້ OAS342.ພວກເຮົາສັງເກດເຫັນວ່າໂດເມນ DI ແລະ DII ຂອງ OAS3 ພົວພັນກັບ CCD ແລະເຂດຈຸດເຊື່ອມຕໍ່ຂະຫນາດນ້ອຍລະຫວ່າງ SH2 ແລະ STAT1 TAD (ຮູບ 4A,F).ການວາງຊ້ອນສະຖານທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ຂ້າມກັນທີ່ແຕກຕ່າງກັນຢູ່ໃນໂຄງສ້າງທາດໂປຼຕີນໄດ້ເປີດເຜີຍປະຕິສໍາພັນລະຫວ່າງ β-sheet ແລະ DBD STAT1 loop ແລະກະເປົ໋າເປີດຫຼືຢູ່ຕາມໂກນທີ່ສ້າງຂຶ້ນໂດຍ residues 60-75 ໃນໂດເມນ DI ຂອງ OAS3 (ຮູບ 4G).ການປະຖົມນິເທດຂອງທາດໂປຼຕີນໃນສະລັບສັບຊ້ອນຍັງຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າບໍ່ມີປະຕິສໍາພັນກັບ OAS3 ແຊກແຊງຄວາມສາມາດຜູກມັດ DNA ຂອງໂດເມນ DI ຂອງມັນ (ຮູບ S1A).ນອກຈາກນັ້ນ, ໂດເມນ N-terminal ຂອງ GTPase MX1 ພົວພັນກັບໂດເມນ DI ແລະ DIII ຂອງ OAS3 (ຮູບ 4A).ພວກເຮົາຍັງໄດ້ສັງເກດເຫັນການໂຕ້ຕອບລະຫວ່າງ OAS1 ແລະ MX1 ໃນທັງສາມ IFNα-treated repeats, ບ່ອນທີ່ໂດເມນ OAS1 ດຽວ (ຍັງໃຊ້ catalytically) ໂຕ້ຕອບກັບທັງສາມໂດເມນ MX1 (ຮູບ S2A,B).
ທາດໂປຼຕີນ MX ແມ່ນສ່ວນຫນຶ່ງຂອງຄອບຄົວຂະຫນາດໃຫຍ່ຂອງ GTPases ຄ້າຍຄື dynein ທີ່ປະກອບດ້ວຍໂດເມນ GTPase N-terminal ທີ່ຜູກມັດແລະ hydrolyzes GTP, ໂດເມນລະດັບກາງທີ່ໄກ່ເກ່ຍການປະກອບຕົນເອງ, ແລະ zipper leucine C-terminal ທີ່ເຮັດຫນ້າທີ່ເປັນ GTPase (LZ. ).ໂດເມນ effector domain25,43.MX1 ຜູກມັດກັບຫົວຫນ່ວຍຍ່ອຍຂອງໂພລິເມີເຣສໄວຣັສເພື່ອສະກັດກັ້ນການຖອດຂໍ້ຄວາມຂອງ gene43 ຂອງໄວຣັສ.ຫນ້າຈໍສອງປະສົມຂອງເຊື້ອລາທີ່ລາຍງານກ່ອນຫນ້ານີ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ PIAS1-associated MX1 ຍັບຍັ້ງການກະຕຸ້ນຂອງເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ STAT1 ໂດຍການຂັດຂວາງກິດຈະກໍາການຜູກມັດ DNA ແລະຍັງມີກິດຈະກໍາ SUMO E344,45 ligase.ໃນທີ່ນີ້, ພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ MX1 ຜູກມັດກັບ STAT1 (ຮູບ 4C, D), ແນວໃດກໍ່ຕາມການໂຕ້ຕອບນີ້ມີຜົນກະທົບຕໍ່ການກະຕຸ້ນຂອງ STAT1-mediated ເພື່ອຕອບສະຫນອງກັບ IFNα ຕ້ອງການການສຶກສາຕື່ມອີກ.ນອກຈາກນັ້ນ, ພວກເຮົາຍັງພົບວ່າ MX1 ພົວພັນກັບ IFIT3 ແລະ DDX60 ໃນທັງສາມ IFNα-treated repeats (ຮູບ S2C).
DDX60 ແມ່ນ IFN-induced cytoplasmic helicase ທີ່ໄດ້ຖືກລາຍງານມາກ່ອນຫນ້ານີ້ເພື່ອມີບົດບາດໃນການທໍາລາຍເອກະລາດ RIG-I ຂອງໄວຣັສ RNA46.ມັນພົວພັນກັບ RIG-I ແລະເປີດໃຊ້ສັນຍານຂອງມັນໃນລັກສະນະສະເພາະຂອງ ligand 46. DDX60 ປະກອບດ້ວຍໂດເມນ helicase DEXD/H-Box ແລະໂດເມນ helicase C-terminal ທີ່ຜູກມັດ RNA ໄວຣັສແລະ DNA47.ການໂຕ້ຕອບສ່ວນໃຫຍ່ຂອງມັນກັບ MX1 ແລະ IFIT3 ເກີດຂຶ້ນພາຍໃນພື້ນທີ່ N- ແລະ C-terminal ຍາວໂດຍບໍ່ມີໂດເມນ canonical ຫຼື motifs (ຮູບ S2E,F).ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, MX1 ຍັງກ່ຽວຂ້ອງກັບໂດເມນ helicase DEXD/H-Box (ຮູບ S2E).ທາດໂປຼຕີນຈາກຄອບຄົວ IFIT ມີສໍາເນົາຄູ່ຂອງ motif helix-turn-helix ທີ່ໂດດເດັ່ນທີ່ເອີ້ນວ່າ tetrapeptide repeat (TPR).IFIT3 ໄດ້ຖືກພົບເຫັນວ່າເປັນຕົວຄວບຄຸມໃນທາງບວກຂອງສັນຍານ RIG-I ແລະດ້ວຍເຫດນີ້ອົງປະກອບຂອງສະລັບສັບຊ້ອນ MAVS.ຮ່ວມກັນ, ຂໍ້ມູນຂອງພວກເຮົາແນະນໍາວ່າ IFIT3 ແລະ DDX60 ໂຕ້ຕອບຕົ້ນຕໍໃນພາກພື້ນລະຫວ່າງ TPR 3-6 ຂອງ IFIT3 ແລະອາດຈະມີບົດບາດໃນສັນຍານ RIG-I/MAVS (ຮູບ S2F).
ເນື່ອງຈາກການກວດສອບ proteome ທັງຫມົດແມ່ນມີຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນໃນຄອມພິວເຕີ້, ຫຼັງຈາກນັ້ນພວກເຮົາໄດ້ກວດເບິ່ງຖານຂໍ້ມູນ UniProt ຂອງມະນຸດທັງຫມົດສໍາລັບການປະກົດຕົວຂອງຫນຶ່ງໃນ IFNα-treated repeats.ໃນແບບຈໍາລອງນີ້, ພວກເຮົາພົບເຫັນເຄືອຂ່າຍການໂຕ້ຕອບທີ່ເຊື່ອຖືໄດ້ຫຼາຍສໍາລັບ HLA-A.ການວິເຄາະເສັ້ນທາງທາດໂປຼຕີນທີ່ຖືກກໍານົດໂດຍ MS / MS spectra ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການປຸງແຕ່ງແລະການນໍາສະເຫນີ antigen ທີ່ອີງໃສ່ MHC-I ແມ່ນເສັ້ນທາງຕົ້ນຕໍທີ່ induced ໂດຍ interferon (ຮູບ 3D).ດັ່ງນັ້ນ, ພວກເຮົາໄດ້ສຸມໃສ່ການສຶກສາປະຕິສໍາພັນຂອງທາດໂປຼຕີນຂອງໂມເລກຸນ MHC-I ທີ່ມີຄວາມຫມັ້ນໃຈສູງໃນທຸກໆຕົວຢ່າງທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ກັນ.HLA ປະກອບດ້ວຍ α1, α2 ແລະ α3 ໂດເມນແລະລະບົບຕ່ອງໂສ້ແສງສະຫວ່າງ, ແລະ microglobulin β2 (β2m) ເປັນທາດໂປຼຕີນຈາກ chaperone ຄົງທີ່49.ເມື່ອປະກອບຢູ່ໃນ reticulum endoplasmic, HLA ແມ່ນບໍ່ຄົງທີ່ໃນກໍລະນີທີ່ບໍ່ມີ peptide ligands50.ຮ່ອງການຜູກມັດ peptide ແມ່ນສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນໂດຍໂດເມນ α1 ແລະ α2 ທີ່ມີໂຄງສ້າງຫຼາຍ polymorphic ແລະບໍ່ມີໂຄງສ້າງໃນຮູບແບບທີ່ບໍ່ແມ່ນ peptide ແລະໂດເມນ polymorphic α351 ຂ້ອນຂ້າງຫນ້ອຍ.ຢູ່ໃນທີ່ປະທັບຂອງ IFNα, ພວກເຮົາໄດ້ກວດພົບສອງສະລັບສັບຊ້ອນ HLA-A: ຫນຶ່ງພົວພັນກັບ HMGA1 ແລະ H2B (ຮູບ 5, ຕາຕະລາງ S3) ແລະອີກອັນຫນຶ່ງພົວພັນກັບ MDN1, LRCH4 ແລະ H2B (ຮູບ 6).
IFNα ກະຕຸ້ນເຄືອຂ່າຍການໂຕ້ຕອບ HLA-A ກັບ H2B (H2BFS) ແລະ HMGA1.(A) 2D plot (ສ້າງໃນຊອຟແວ SIM-XL) depicting ປະເພດທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງການໂຕ້ຕອບໃນ H2B-HLA-A-HMGA1 complex: interlink (ສີຟ້າ), interlink (ສີແດງ) ແລະການເຊື່ອມຕໍ່ດຽວ (ສີດໍາ)..ໂດເມນຂອງຕົວຕົນທີ່ແຕກຕ່າງກັນແມ່ນລະຫັດສີ 32: H2B (histone; 2–102) ແລະ MHC-I (MHC_1; 25–203, ກຸ່ມ C1; 210–290 ແລະ MHC_I_C; 337–364).ເກນຂ້າມເຊື່ອມຕໍ່ຖືກຕັ້ງຢູ່ທີ່ 3.5.ແຜນຜັງຈຸດຊີ້ໃຫ້ເຫັນສະຖານທີ່ປະຕິສໍາພັນ HLA-A ກັບ H2B (B) ແລະ HMGA1 (C), ເຊັ່ນດຽວກັນກັບສະຖານທີ່ປະຕິສໍາພັນ K ຫຼື S ລະຫວ່າງສອງ peptides.ໃນຮູບ, ຂອບເຂດຄະແນນການເຊື່ອມຕໍ່ຂ້າມແມ່ນຖືກກໍານົດເປັນ 3.0.(D) ຄວາມສໍາພັນລະຫວ່າງທາດໂປຼຕີນທີ່ສະແດງຢູ່ໃນໂຄງສ້າງຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ H2B, HLA-A, ແລະ HMGA1 ໃນໂຄງການ PyMOL.ໂຄງສ້າງເຫຼົ່ານີ້ຖືກສ້າງແບບຈໍາລອງໂດຍໃຊ້ເຊີບເວີ Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ແລະໂຄງສ້າງແມ່ແບບສໍາລັບໂປຣຕີນ H2B, HLA-A ແລະ HMGA1 ແມ່ນ 1kx552, 1kj349 ແລະ 2eze55, ຕາມລໍາດັບ.
IFNα ກະຕຸ້ນເຄືອຂ່າຍການໂຕ້ຕອບ HLA-A ກັບ H2B (H2BFS), MDN1 ແລະ LRCH4.(A) Intramolecular (ສີແດງ) ແລະ intermolecular (ສີຟ້າ) crosslinks ນໍາສະເຫນີຢູ່ໃນແຜນທີ່ແບບໂຕ້ຕອບ 2D (ສ້າງຂຶ້ນໃນຊອບແວ SIM-XL) ກັບ MDN1 ເປັນຕົວແທນເປັນວົງ.ເກນຂ້າມເຊື່ອມຕໍ່ຖືກຕັ້ງຢູ່ທີ່ 3.5.ໂດເມນຂອງຕົວຕົນທີ່ແຕກຕ່າງກັນແມ່ນລະຫັດສີ 32: H2B (histone; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, ກຸ່ມ C1; 210–290 ແລະ MHC_I_C; 337–364) ແລະ LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) ແລະ CH (535–641)).(B) ຄວາມສໍາພັນລະຫວ່າງທາດໂປຼຕີນທີ່ສະແດງຢູ່ໃນໂຄງສ້າງຂອງໂປຣຕີນ H2B, HLA-A, LRCH4, ແລະ MDN1 ໃນໂຄງການ PyMOL.ໂຄງສ້າງເຫຼົ່ານີ້ຖືກສ້າງແບບຈໍາລອງໂດຍໃຊ້ເຊີບເວີ Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ດ້ວຍໂຄງສ້າງແມ່ແບບ 1kx552, 1kj349, 6hlu62 ແລະ 6i2665 ສໍາລັບໂປຣຕີນ H2B, HLA-A, LRCH4 ແລະ MDN1, ຕາມລໍາດັບ.ແຜນຜັງຈຸດສະແດງສະຖານທີ່ການໂຕ້ຕອບ K ຫຼື S ສໍາລັບ HLA-A ກັບ H2B (C), LRCH4 (D), ແລະ MDN1 (E).ສຳລັບແຜນຜັງ, ເກນຄະແນນຂ້າມເຊື່ອມຕໍ່ຖືກຕັ້ງເປັນ 3.0.
ນອກເຫນືອຈາກການຮັກສາຄວາມສົມບູນຂອງ genome, histone H2B ຍັງມີສ່ວນຮ່ວມໃນລະບຽບການຂອງການຖ່າຍທອດ.ທາດໂປຼຕີນຈາກ H2B ປະກອບດ້ວຍໂດເມນ histone ກາງ (HFD) ສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນໂດຍສາມ α-helices ແຍກອອກໂດຍ loops ແລະຫາງ C-terminal 41,52.ປະຕິສໍາພັນກັບ H2B ສ່ວນໃຫຍ່ເກີດຂຶ້ນໃນ α1 helix, ເຊິ່ງສະຫນອງ trimerization ກັບ HFD heterodimer (ຮູບ 5A, B).ເຖິງແມ່ນວ່າ lysins ມີສ່ວນຮ່ວມໃນການຜູກມັດ DNA, ບາງ lysins ຍັງເປັນທາງເລືອກ acetylation ຫຼືສະຖານທີ່ methylation.ຕົວຢ່າງ, ສ່ວນທີ່ເຫຼືອ K43, K46, ແລະ K57 ຈາກ H2B ບໍ່ໄດ້ມີສ່ວນຮ່ວມໃນການຜູກມັດ DNA ໂດຍກົງ, ແຕ່ເປັນເປົ້າໝາຍຂອງການດັດແກ້ຫຼັງການຖອດຂໍ້ຄວາມຕ່າງໆ53.ເຊັ່ນດຽວກັນ, residue K44, K47, ແລະ K57 ໃນ H2B ອາດຈະມີບົດບາດທາງເລືອກໃນການປະກົດຕົວຂອງ IFNα, ລວມທັງປະຕິສໍາພັນກັບທາດໂປຼຕີນອື່ນໆ (ຮູບ 5A, B).ນອກຈາກນັ້ນ, extrachromosomal histone H2B ກະຕຸ້ນການຕອບສະຫນອງຂອງພູມຕ້ານທານໃນຈຸລັງປະເພດຕ່າງໆ, ເຮັດຫນ້າທີ່ເປັນເຊັນເຊີ cytosolic ເພື່ອກວດຫາຊິ້ນສ່ວນ DNA ຄູ່ (dsDNA) ທີ່ມາຈາກຕົວແທນຕິດເຊື້ອຫຼືຈຸລັງທີ່ເສຍຫາຍ54.ໃນທີ່ປະທັບຂອງໄວຣັສ DNA, ການຫຼຸດລົງຂອງ H2B ຂັດຂວາງການຜະລິດ IFN-βແລະ STAT154 phosphorylation.H2B ຍັງເປັນທີ່ຮູ້ກັນວ່າເຄື່ອນຍ້າຍເຂົ້າ ແລະ ອອກຈາກນິວເຄລຍໄດ້ໄວກວ່າ histones ຫຼັກອື່ນໆ54.ປະຕິສໍາພັນ H2B ກັບ MDN1 ແລະ LRCH4 ຍັງໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນຢູ່ໃນຕົວຢ່າງທີ່ບໍ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວທີ່ເລືອກ.ພວກເຮົາພົບວ່າ HLA-A ມີປະຕິກິລິຍາກັບ H2B ໃນທັງສາມຕົວຢ່າງທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວ IFNα ແລະໃນຕົວຢ່າງຫນຶ່ງທີ່ບໍ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວ.ຂໍ້ມູນເຫຼົ່ານີ້ສະທ້ອນໃຫ້ເຫັນເຖິງບົດບາດຂອງ H2B ໃນຫນ້າທີ່ທາງຊີວະວິທະຍາທາງເລືອກທີ່ເປັນເອກະລາດຂອງກົດລະບຽບການຖອດຂໍ້ຄວາມ.
HMGA1 (ກຸ່ມທີ່ມີການເຄື່ອນໄຫວສູງ AT-Hook 1), ນິວຄລີໂອໂປຣຕີນຂະໜາດນ້ອຍທີ່ອຸດົມໄປດ້ວຍອາຊິດ amino ທີ່ສົ່ງເສີມພະຍາດ, ໄດ້ຖືກລະບຸວ່າມີການເຊື່ອມໂຍງກັບ HLA-A.ມັນມີຫາງ C-terminal ທີ່ເປັນກົດ ແລະສາມ DBD ທີ່ແຕກຕ່າງກັນທີ່ເອີ້ນວ່າ AT hooks ເພາະວ່າພວກມັນຜູກມັດກັບຮ່ອງເລັກນ້ອຍຂອງພາກພື້ນທີ່ອຸດົມສົມບູນ AT ໃນ dsDNA55,56.ການຜູກມັດນີ້ເຮັດໃຫ້ DNA ງໍຫຼືກົງ, ອະນຸຍາດໃຫ້ປັດໄຈການຖອດຂໍ້ຄວາມ canonical ເຂົ້າເຖິງລໍາດັບຄວາມເຫັນດີຂອງມັນ.ຫາງ C-terminal ເຊື່ອກັນວ່າມີສ່ວນຮ່ວມໃນປະຕິສໍາພັນຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກທາດໂປຼຕີນແລະການທົດແທນຂອງປັດໃຈການຖ່າຍທອດ, ເນື່ອງຈາກວ່າ C-terminal deletion mutants ບໍ່ສາມາດເລີ່ມຕົ້ນ transcription57.ຍິ່ງໄປກວ່ານັ້ນ, ໂດເມນນີ້ປະກອບດ້ວຍສະຖານທີ່ phosphorylation ທີ່ຖືກອະນຸລັກຫຼາຍທີ່ຮູ້ຈັກກັບ substrates ສໍາລັບ kinases 58 .ພວກເຮົາໄດ້ສັງເກດເຫັນປະຕິສໍາພັນ HLA-A ແລະ H2B ກັບ HMGA1 ຢູ່ນອກໂດເມນ C-terminal, ແນະນໍາວ່າໂດເມນ C-terminal ສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນໃຊ້ສໍາລັບການຜູກມັດປັດໄຈການຖອດຂໍ້ຄວາມ (ຮູບ 5A, C).ໂປຣຕີນ HMGA ແຂ່ງຂັນກັບ histone H1 ສໍາລັບການຜູກມັດກັບອະແດບເຕີ DNA, ດັ່ງນັ້ນການເພີ່ມການເຂົ້າເຖິງ57.ເຊັ່ນດຽວກັນ, ມັນເບິ່ງຄືວ່າ HMGA ພົວພັນກັບ histone H2B ຕາມຕົວເຊື່ອມຕໍ່ DNA ໃນການແຂ່ງຂັນກັບ histone H1.HMGB1 induces ການສະແດງອອກຂອງ HLA-A, -B, ແລະ -C ໃນຈຸລັງ dendritic, ນໍາໄປສູ່ການ activation ຂອງເຂົາເຈົ້າ59, ແຕ່ປະຕິສໍາພັນລະຫວ່າງ HMG ແລະ HLA ບໍ່ໄດ້ຖືກລາຍງານກ່ອນຫນ້ານີ້.ພວກເຮົາພົບເຫັນວ່າ HMGA1 ພົວພັນກັບ α1 ແລະ α3 ໂດເມນຂອງ HLA-A, ການໂຕ້ຕອບສ່ວນໃຫຍ່ຢູ່ນອກ 3 DBD ຂອງມັນ (ຮູບ 5A,C).ຢູ່ໃນມືຂອງພວກເຮົາ, HLA-A ໄດ້ຖືກພົບເຫັນວ່າຖືກທ້ອງຖິ່ນຢູ່ໃນແກນ (ຂໍ້ມູນບໍ່ໄດ້ສະແດງ), ແລະຍ້ອນວ່າ H2B ແລະ HMGA1 ຍັງມີຢູ່ໃນແກນ, ປະຕິສໍາພັນນີ້ອາດຈະເກີດຂື້ນໃນແກນ.adducts ສະເພາະທີ່ວັດແທກລະຫວ່າງ H2B, HLA-A, ແລະ HMGA1 ແມ່ນສະແດງຢູ່ໃນຮູບ 5D.
ປະຕິສໍາພັນສ່ວນໃຫຍ່ຂອງ HLA-A ກັບໂປຣຕີນອື່ນໆເກີດຂື້ນພາຍໃນໂດເມນ α1 ແລະ α2 ຂອງມັນແລະໂດເມນ C-terminal ທີ່ບໍ່ເປັນລະບຽບ (ຮູບ 6).ໃນຫນຶ່ງໃນຕົວຢ່າງເຫຼົ່ານີ້, ພວກເຮົາພົບວ່າ HLA-A ພົວພັນກັບຫາງ N-terminal ທີ່ບໍ່ເປັນລະບຽບຂອງ LRCH4 (ຮູບ 6A,D).LRCH4 ຄວບຄຸມການກະຕຸ້ນ TLR4 ແລະ LPS cytokine induction, ດັ່ງນັ້ນ modulating ການຕອບສະຫນອງຂອງພູມຕ້ານທານພາຍໃນ60,61.ມັນເປັນທາດໂປຼຕີນຈາກເຍື່ອທີ່ມີເກົ້າ leucine-rich repeats (LRRs) ແລະ motif homology calmodulin (CH) ໃນ ectodomain ຂອງມັນ, ຕາມດ້ວຍ transmembrane domain (TMD) 60 , 62 .ໂດເມນ CH ໄດ້ຖືກລາຍງານເພື່ອໄກ່ເກ່ຍປະຕິສໍາພັນຂອງທາດໂປຼຕີນ - ໂປຣຕີນ 60 .ການຍືດຕົວຂອງອາຊິດ amino ປະມານ 300 ລະຫວ່າງໂດເມນ LRR ແລະ CH ແມ່ນຂ້ອນຂ້າງເຂົ້າເຖິງໄດ້ແຕ່ບໍ່ເປັນລະບຽບ.ອີງຕາມການທໍາງານຂອງພາກພື້ນທີ່ບໍ່ເປັນລະບຽບເປັນຜູ້ໄກ່ເກ່ຍຂອງເຄືອຂ່າຍທາດໂປຼຕີນຈາກທາດໂປຼຕີນແລະການຂົນສົ່ງ vesicular 63, ພວກເຮົາພົບເຫັນວ່າປະຕິສໍາພັນຂອງທາດໂປຼຕີນສ່ວນໃຫຍ່ເກີດຂື້ນໃນພາກພື້ນທີ່ບໍ່ເປັນລະບຽບ.ປະຕິສໍາພັນກັບ MDN1 ໄດ້ຖືກແຈກຢາຍໃນທົ່ວຄວາມຍາວຂອງທາດໂປຼຕີນ, ລວມທັງໂດເມນ LRR1, LRR6, CH, ແລະພາກພື້ນແບບສຸ່ມ, ໃນຂະນະທີ່ H2B ສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນຜູກມັດກັບໂດເມນ CH (ຮູບ 6A, B).ໂດຍສະເພາະ, ບໍ່ມີການໂຕ້ຕອບໃດໆລວມເອົາ TMJ, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງຄວາມສະເພາະຂອງວິທີການ CLMS (ຮູບ 6A, B).
MDN1 ຍັງໄດ້ຖືກລະບຸວ່າເປັນສ່ວນຫນຶ່ງຂອງເຄືອຂ່າຍທາດໂປຼຕີນຈາກ HLA-A (ຮູບ 6A).ມັນເປັນຂອງຄອບຄົວ AAA ຂອງທາດໂປຼຕີນ (ATPases ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບກິດຈະກໍາທີ່ແຕກຕ່າງກັນ).ນີ້ແມ່ນໂດເມນ AAA N-terminal ດຽວກັນທີ່ຈັດເປັນວົງ hexameric ແລະເອົາປັດໃຈປະກອບຈາກ 60S 64 ribosomal subunit.ເບິ່ງຄືວ່າຄ້າຍຄືກັນກັບ dynein64,65,66.ນອກຈາກນັ້ນ, ພາກພື້ນທີ່ອຸດົມສົມບູນ Asp / Glu ແມ່ນປະຕິບັດຕາມໂດຍໂດເມນ MIDAS (ສະຖານທີ່ຂຶ້ນກັບ ion ໂລຫະ).ເນື່ອງຈາກຂະຫນາດຂອງ MDN1 ຂະຫນາດໃຫຍ່ (ປະມານ 5600 ອາຊິດ amino) ແລະ homology ຈໍາກັດຂອງມັນກັບທາດໂປຼຕີນທີ່ໄດ້ຮັບການສຶກສາດີ, ບໍ່ຄ່ອຍຮູ້ກ່ຽວກັບໂຄງສ້າງແລະຫນ້າທີ່ຂອງມັນຢູ່ໃນມະນຸດ.ພວກເຮົາໄດ້ກໍານົດ HLA-A, H2B, ແລະ LRCH4 ເປັນຄູ່ຮ່ວມງານຜູກມັດ MDN1 ແລະເປີດເຜີຍການປະຖົມນິເທດຂອງເຂົາເຈົ້າເປັນສະລັບສັບຊ້ອນທາດໂປຼຕີນໃນ PyMol (ຮູບ 6A,B).ສາມທາດໂປຼຕີນເຫຼົ່ານີ້ພົວພັນກັບໂດເມນ AAA, ໂດເມນຕົວເຊື່ອມຕໍ່ຄ້າຍຄື dynein, ແລະອາດຈະເປັນໂດເມນ MIDAS MDN1.ໃນບົດລາຍງານທີ່ຜ່ານມາ, ການຊໍາລະຄວາມໃກ້ຊິດຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ bait ໄດ້ກໍານົດ MDN1 ເປັນທາດໂປຼຕີນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ histone H2B67.ນອກຈາກນັ້ນ, ການສຶກສາທີ່ຜ່ານມາຍັງໄດ້ລາຍງານການພົວພັນລະຫວ່າງ MDN ແລະ HLA-B ໃນຈຸລັງ HCT116 ໂດຍໃຊ້ affinity-purified mass spectrometry, ສະຫນັບສະຫນູນການຄົ້ນພົບຂອງພວກເຮົາ68.ການກໍານົດສະລັບສັບຊ້ອນນີ້ໃນຕົວຢ່າງທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ IFNα ຊີ້ໃຫ້ເຫັນບົດບາດສໍາລັບ MDN1 ໃນສັນຍານ interferon.
ເນື່ອງຈາກວ່າ HLA genes ມີ polymorphic ສູງ, ພວກເຮົາສະກັດ sequencing ອ່ານແຜນທີ່ HLA-A, -B, ແລະ -C ຈາກຂໍ້ມູນລໍາດັບ RNA ຂອງ Flo-1 ຈຸລັງ (ຂໍ້ມູນບໍ່ໄດ້ສະແດງ).ລໍາດັບ Peptide ທີ່ສອດຄ່ອງກັບການອ່ານລໍາດັບໄດ້ເປີດເຜີຍຄວາມແຕກຕ່າງທີ່ສໍາຄັນລະຫວ່າງ HLA-A, -B, ແລະ -C ໃນເຂດທີ່ peptides ຂ້າມເຊື່ອມຕໍ່ຢູ່ໃນ HLA-A (ຮູບ S3).ນອກຈາກນັ້ນ, ພວກເຮົາບໍ່ໄດ້ສັງເກດເຫັນການເຊື່ອມໂຍງຂ້າມຂອງໂປຣຕີນກັບໂປຣຕີນຂອງໂມເລກຸນ HLA-B/C ກັບໂປຣຕີນ H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.ນີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າປະຕິສໍາພັນຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ພົບລະຫວ່າງ HLA-A, MDN1, LRCH1 ແລະ HMGA1 ແມ່ນສະເພາະ HLA-A.ນອກຈາກນັ້ນ, ການວິເຄາະ proteomic ຂອງຕົວຢ່າງທີ່ບໍ່ແມ່ນການເຊື່ອມຕໍ່ຂ້າມ (ຕາຕະລາງ S4) ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ HLA-A ມີການຄຸ້ມຄອງລໍາດັບທີ່ສູງກວ່າເມື່ອທຽບກັບ HLA-B ຫຼື HLA-C.peptides ທີ່ລະບຸໄວ້ສໍາລັບ HLA-A ແມ່ນມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສູງໃນທັງສອງຕົວຢ່າງ IFNα ທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວແລະບໍ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວ.
ເພື່ອຮັບປະກັນວ່າປະຕິສໍາພັນທີ່ລະບຸຢູ່ທີ່ນີ້ບໍ່ແມ່ນຍ້ອນການເຊື່ອມໂຍງກັນລະຫວ່າງສອງໂປຣຕີນທີ່ບໍ່ສະເພາະຢູ່ໃນພື້ນທີ່ໃກ້ຊິດ, ພວກເຮົາຢືນຢັນຕື່ມອີກສອງປັດໃຈປະຕິສໍາພັນ HLA-A ໂດຍປະຕິບັດການວິເຄາະຮ່ວມກັນຂອງ immunoprecipitation.ປະຕິສໍາພັນ HLA-A ກັບ endogenous MDN1 ແລະ H2B ໄດ້ຖືກກວດພົບໃນທັງສອງຈຸລັງ Flo-1 ທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ IFNα ແລະບໍ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວ (ຮູບ 7, ຮູບ S4).ພວກເຮົາໄດ້ຢືນຢັນວ່າ HLA-A ໄດ້ຖືກຈັບໂດຍ H2B ໃນ immunoprecipitates ແລະວ່າສະມາຄົມນີ້ແມ່ນເນື່ອງມາຈາກການປິ່ນປົວ IFNα ນັບຕັ້ງແຕ່ HLA-A ບໍ່ມີຢູ່ໃນຕົວຢ່າງ immunoprecipitate ຈາກຈຸລັງທີ່ບໍ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວ (ຮູບ 7A).ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ຂໍ້ມູນຂອງພວກເຮົາແນະນໍາວ່າ IFNα ຄວບຄຸມຄວາມແຕກຕ່າງຂອງ HLA-A ຜູກມັດກັບ H2B ແລະ MDN1.IFNα induces ສະມາຄົມລະຫວ່າງ H2B ແລະ HLA-A, ແຕ່ຫຼຸດຜ່ອນການພົວພັນກັບ MDN1.ພວກເຮົາພົບວ່າ MDN1 ມີຄວາມກ່ຽວຂ້ອງກັບ HLA-A ໃນການຄວບຄຸມ, ແລະການເພີ່ມເຕີມຂອງ IFNα ຫຼຸດລົງການໂຕ້ຕອບນີ້ເອກະລາດຂອງການ induction MDN1 ໂດຍ IFNα (ຮູບ 7B,C).ນອກຈາກນັ້ນ, HLA-A immunoprecipitation captured H2B ໃນຈຸລັງ A549 (ຮູບ S4), ແນະນໍາວ່າການໂຕ້ຕອບນີ້ແມ່ນເອກະລາດຂອງປະເພດເຊນ.ຮ່ວມກັນ, ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ສະຫນັບສະຫນູນການໂຕ້ຕອບ interferon-mediated ຂອງ HLA-A ກັບ H2B ແລະ MDN1.
HLA-A ຮ່ວມກັນຊໍາລະລ້າງ H2B ແລະ MDN1.ຕົວແທນ endogenous H2B (A) ແລະ MDN1 (B) immunoblots ໄດ້ຖືກ immunoprecipitated ຈາກຈຸລັງ Flo-1 ທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວ IFNα ແລະ probed ສໍາລັບພູມຕ້ານທານທີ່ລະບຸໄວ້.ຫນູແລະກະຕ່າຍ IgG ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນການຄວບຄຸມທາງລົບ.(C) ປະລິມານທີ່ກ່ຽວຂ້ອງ (ວັດສະດຸປ້ອນ) ຂອງ antigens ທີ່ແຕກຕ່າງກັນແມ່ນສະແດງໂດຍ immunoblots probed ຕ້ານ antibodies ຊີ້ບອກ, β-actin ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນການຄວບຄຸມການໂຫຼດ.
ຄຸນສົມບັດໂຄງສ້າງຂອງຫນຶ່ງໃນເຄືອຂ່າຍເຊື່ອມຕໍ່ຂ້າມ interferon ທີ່ເຊື່ອຖືໄດ້ສູງ, H2B-HLA-A-HMGA1, ໄດ້ຖືກສືບສວນ.ພວກເຮົາໄດ້ນໍາໃຊ້ການສ້າງແບບຈໍາລອງຂອງໂມເລກຸນເປັນວິທີການທາງເລືອກເພື່ອເຂົ້າໃຈນະໂຍບາຍດ້ານການສອດຄ່ອງຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບສະລັບສັບຊ້ອນນີ້ (ຮູບ 8).Inferences ຈາກຂໍ້ມູນ CLMS ຊີ້ໃຫ້ເຫັນຄວາມເປັນໄປໄດ້ຂອງຄວາມສອດຄ່ອງທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ H2B, HLA-A, ແລະ HMGA1.ດັ່ງນັ້ນ, ສະລັບສັບຊ້ອນທີ່ມີທ່າແຮງຕໍ່ໄປນີ້ໄດ້ຖືກສ້າງແບບຈໍາລອງຢູ່ໃນຕົວກາງຂອງສານລະລາຍ: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A, ແລະ H2B-HLA-A-HMGA1.ຫນ້າຈໍ docking ທາດໂປຼຕີນຈາກທາດໂປຼຕີນໃນເບື້ອງຕົ້ນໂດຍໃຊ້ MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) ແນະນໍາການສອດຄ່ອງທີ່ເປັນໄປໄດ້ທີ່ແຕກຕ່າງລະຫວ່າງທາດໂປຼຕີນເຫຼົ່ານີ້ (ຮູບ 8A).ການສະແດງພາບຂອງໂປຣຕີນທີ່ຕັ້ງ docking ໄດ້ເປີດເຜີຍປະຕິສໍາພັນຫຼາຍອັນ ແລະຄວາມສອດຄ່ອງທີ່ເປັນໄປໄດ້ (ຮູບ 5A, 8).ດັ່ງນັ້ນ, ຫນຶ່ງໃນຄວາມສອດຄ່ອງທີ່ເປັນໄປໄດ້ແມ່ນສະແດງຢູ່ໃນຮູບ 8A (ມີປ້າຍຊື່ຂ້າມເຊື່ອມຕໍ່) ແລະມັນໄດ້ຖືກປະເມີນຕື່ມອີກໂດຍໃຊ້ທໍ່ສ້າງແບບຈໍາລອງ MD.ນອກຈາກນັ້ນ, ການຜູກມັດຂອງ H2B ຫຼື HMGA1 ກັບ HLA-A ຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງຄວາມໃກ້ຊິດທີ່ສູງຂຶ້ນຂອງ H2B ສໍາລັບ HLA-A (ຮູບ 8A).
ນະໂຍບາຍດ້ານການສອດຄ່ອງຂອງເຄືອຂ່າຍທີ່ເປັນໄປໄດ້ລະຫວ່າງ H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A, ແລະ H2B-HLA-A-HMGA1 complexes.(A) ແຜງດ້ານຊ້າຍແມ່ນແຜນທີ່ 2D (ສ້າງຂຶ້ນໃນຊອຟແວ SIM-XL) ຂອງ intramolecular (ສີແດງ) ແລະ intermolecular (ສີຟ້າ) crosslinks (crosslink cutoff ກໍານົດເປັນ 3.5).ນອກຈາກນັ້ນ, ສານຕົກຄ້າງຂອງການເຊື່ອມໂຍງຂ້າມທີ່ລະບຸໄວ້ແມ່ນຕິດສະຫຼາກຢູ່ໃນໂຄງສ້າງຂອງໂປຣຕີນ H2B, HLA-A, ແລະ HMGA1.ຄວາມສອດຄ່ອງກັນຂອງທາດໂປຼຕີນເຫຼົ່ານີ້ໄດ້ຖືກສະກັດອອກໂດຍໃຊ້ທໍ່ docking ປະຕິບັດຢູ່ໃນຊຸດ MOE.ແຜງດ້ານຊ້າຍລຸ່ມສະແດງໃຫ້ເຫັນຄວາມສອດຄ່ອງທີ່ເປັນໄປໄດ້ຂອງສະລັບສັບຊ້ອນ H2B-HLA-A ແລະ HMGA1-HLA-A ທີ່ມີຄວາມກ່ຽວຂ້ອງກັນຂອງທາດໂປຼຕີນ - ທາດໂປຼຕີນທີ່ແຕກຕ່າງກັນ (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) ມາດຕະຖານ deviation (RMSD) ຂອງຕໍາແຫນ່ງປະລໍາມະນູ (ບໍ່ລວມອາຕອມ hydrogen) ສໍາລັບແຕ່ລະໂຄງສ້າງທາດໂປຼຕີນ.(C) Intermolecular protein-protein ພັນທະບັດ hydrogen intermolecular ປະຕິສໍາພັນຈາກສະລັບສັບຊ້ອນ simulated ຕ່າງໆພິຈາລະນາການໂຕ້ຕອບສະເພາະຂອງໄລຍະເວລາ ≥ 10 ns.ໄລຍະຫ່າງການຕັດຕົວຮັບຜູ້ໃຫ້ທຶນ h-bond ຖືກຕັ້ງເປັນ 3.5 Å, ແລະມຸມຕັດຂອງ donor-H-acceptor ຖືກຕັ້ງເປັນ ≥ 160°–180°.(D) ສານຕົກຄ້າງທີ່ມີປ້າຍກຳກັບທີ່ສ້າງປະຕິສຳພັນໂປຣຕີນ-ທາດໂປຼຕີນຈາກ HLA-A ກັບຄູ່ຮ່ວມຂອງພວກມັນ, ຂະຫຍາຍ ≥ 20 ns, ສະກັດຈາກ dummy HLA-A-H2B ແລະ HLA-A-HMGA1 complexes.ໂຄງສ້າງທາດໂປຼຕີນເປັນຕົວແທນຂອງໂຄງສ້າງສະເລ່ຍຂອງ 100 ns MDS.(E) ການໂຕ້ຕອບລະຫວ່າງ HLA-A-H2B ແລະ HLA-A-HMGA1 ສະລັບສັບຊ້ອນເມື່ອທຽບກັບການໂຕ້ຕອບທີ່ຕິດຕາມໂດຍການຈໍາລອງ H2B-HLA ຫຼາຍກວ່າ 100 ns ໂດຍອີງໃສ່ສະຖານທີ່ການໂຕ້ຕອບ K ຫຼື S ລະຫວ່າງສອງ peptides.ຊັບຊ້ອນ /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.ມູນຄ່າເກນສໍາລັບການປະເມີນຜົນຂອງການເຊື່ອມຕໍ່ຂ້າມແມ່ນຖືກກໍານົດເປັນ 3.0, ແລະການໂຕ້ຕອບສະເພາະຈາກ MDS ທີ່ກິນ ≥ 10 ns ໄດ້ຖືກພິຈາລະນາ.ໂຄງສ້າງຂອງທາດໂປຼຕີນໄດ້ຖືກສະແດງເປັນພາບໂດຍໃຊ້ BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) ແລະ ສະພາບແວດລ້ອມການເຮັດວຽກຂອງໂມເລກຸນ (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada).
ຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງໂມເລກຸນ HLA-A ໃນໄລຍະເວລາ (ມາດຕະຖານ deviation; RMSD ຫຼືມາດຕະຖານ deviation; RMSF) ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າການມີທາດໂປຼຕີນຈາກ H2B ຫຼື HMGA1 ໃນສະລັບສັບຊ້ອນເຮັດໃຫ້ HLA-A ສະຖຽນລະພາບ (ຮູບ 8B, ຮູບ S5).ທາດໂປຼຕີນຈາກ HMGA1 ຜູກມັດກັບສະຖານທີ່ B2M ຂອງ HLA-A, ເຮັດໃຫ້ຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງອາຊິດ amino HLA-A ໃນສະລັບສັບຊ້ອນ HLA-A-HMGA1 ຫຼື H2B-HLA-A-HMGA1 (ຮູບ 8B, ຮູບ S5).ໂດຍສະເພາະ, HLA residues ~60-90 ແລະ ~180-210 ໄດ້ຖືກພົບເຫັນວ່າມີຄວາມຍືດຫຍຸ່ນຫນ້ອຍໃນການປະກົດຕົວຂອງ H2B (ຮູບ 8B).H2B ແລະ HMGA1 ສະແດງໃຫ້ເຫັນການຜູກມັດທີ່ດີກວ່າກັບ HLA-A ໃນສະລັບສັບຊ້ອນ H2B-HLA-A-HMGA1 ເມື່ອທຽບກັບການຜູກມັດ HLA-A ກັບ H2B ຫຼື HMGA1 ຢ່າງດຽວ (ຮູບ 8C,D; ຕາຕະລາງ S5).ສານຕົກຄ້າງທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການຜູກມັດ hydrogen (MD modeled high occupancy ≥ 10 ns) coincide with CLMS interaction sites (K or S residues) in the complex, ແນະນໍາວ່າການໂຕ້ຕອບທີ່ກໍານົດໂດຍ CLMS ແມ່ນມີຄວາມຫນ້າເຊື່ອຖືຫຼາຍ.ຄວາມຫນ້າເຊື່ອຖື (ຮູບ 8E ).ໃນແບບຈໍາລອງ CLMS ແລະ MD, ການຕົກຄ້າງຂອງ HLA-A ລະຫວ່າງປະມານ 190-210 ແລະປະມານ 200-220 ອາຊິດ amino ໄດ້ຖືກພົບເຫັນວ່າຜູກມັດ H2B ແລະ HMGA1, ຕາມລໍາດັບ (ຮູບ 8E).
ປະຕິສໍາພັນຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກທາດໂປຼຕີນປະກອບເປັນເຄືອຂ່າຍໂຄງສ້າງແບບເຄື່ອນໄຫວທີ່ໄກ່ເກ່ຍການສື່ສານ intracellular ໃນການຕອບສະຫນອງຕໍ່ການກະຕຸ້ນບາງຢ່າງ.ເນື່ອງຈາກວ່າວິທີການ proteomics ຈໍານວນຫຼາຍກວດພົບການປ່ຽນແປງໃນລະດັບຄວາມຫມັ້ນຄົງໂດຍລວມຂອງທາດໂປຼຕີນ, ນະໂຍບາຍດ້ານປະຕິສໍາພັນຂອງທາດໂປຼຕີນ - ທາດໂປຼຕີນຕ້ອງການເຄື່ອງມືເພີ່ມເຕີມເພື່ອເກັບກໍາການໂຕ້ຕອບການຜູກມັດ, ແລະ CLMS ແມ່ນເຄື່ອງມືຫນຶ່ງດັ່ງກ່າວ.ລະບົບສັນຍານ interferon ເປັນເຄືອຂ່າຍ cytokine ທີ່ອະນຸຍາດໃຫ້ຈຸລັງຕອບສະຫນອງຕໍ່ລະດັບຂອງສັນຍານ pathological ທາງດ້ານສິ່ງແວດລ້ອມແລະພາຍໃນ, culminating ໃນ induction ຂອງ subsets ຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ interferon-inducible.ພວກເຮົາໄດ້ນໍາໃຊ້ CLMS ເພື່ອກໍານົດວ່າປະຕິສໍາພັນຂອງທາດໂປຼຕີນ - ທາດໂປຼຕີນຈາກໃຫມ່ສາມາດຖືກກໍານົດລະຫວ່າງຄະນະກໍາມະຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ interferon.ການວິເຄາະການເຊື່ອມໂຍງຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກທົ່ວໂລກໃນຮູບແບບຈຸລັງ Flo-1 ທີ່ຕອບສະຫນອງ interferon ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອເກັບກໍາທາດໂປຼຕີນຈາກສະລັບສັບຊ້ອນ.ການສະກັດເອົາ peptides tryptic ຈາກຈຸລັງທີ່ບໍ່ເຊື່ອມຕໍ່ແລະຂ້າມເຊື່ອມຕໍ່ອະນຸຍາດໃຫ້ສໍາລັບການນັບ peptide, ການເສີມສ້າງເສັ້ນທາງ, ແລະການແຈກຢາຍຄວາມຍາວ peptide ທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ LFQ ທີ່ກໍານົດໄວ້.ທາດໂປຼຕີນຈາກ interferon-inducible Canonical ໄດ້ຖືກລະບຸວ່າເປັນການຄວບຄຸມພາຍໃນໃນທາງບວກ, ໃນຂະນະທີ່ການເຊື່ອມສານກັນຂ້າມຂອງ adducts interferon-inducible ໃຫມ່ຂອງ canonical interferon-inducible ເຊັ່ນ MX1, UP18, OAS3 ແລະ STAT1 ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນ.ລັກສະນະໂຄງສ້າງຕ່າງໆແລະການໂຕ້ຕອບໃນພື້ນທີ່ທີ່ເປັນປະໂຫຍດໄດ້ຖືກສືບສວນ.
ປະຕິສໍາພັນລະຫວ່າງ HLA-A, MDN1 ແລະ H2B ໄດ້ຖືກກວດພົບໂດຍ immunoblotting ໃນຈຸລັງ Flo-1 ແລະ A549 ທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວແລະບໍ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ IFNα.ຜົນໄດ້ຮັບຂອງພວກເຮົາເນັ້ນຫນັກວ່າ HLA-A ສະລັບສັບຊ້ອນກັບ H2B ໃນລັກສະນະທີ່ຂຶ້ນກັບIFNα.ວຽກງານຂອງພວກເຮົາເປັນຕົວແທນໃຫ້ເສັ້ນທາງທີ່ຫນ້າສົນໃຈສໍາລັບການຂຸດຄົ້ນຕື່ມອີກຂອງການຮ່ວມທ້ອງຖິ່ນຂອງສອງສະລັບສັບຊ້ອນເຫຼົ່ານີ້.ມັນຍັງເປັນສິ່ງທີ່ຫນ້າສົນໃຈທີ່ຈະຂະຫຍາຍວິທີການ CLMS ໄປຫາກະດານຂອງສາຍເຊນເພື່ອກໍານົດການໂຕ້ຕອບຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ interferon ທີ່ເປັນເອກະລາດຂອງເຊນ.ສຸດທ້າຍ, ພວກເຮົາໄດ້ນໍາໃຊ້ການສ້າງແບບຈໍາລອງ MD ເປັນວິທີການທາງເລືອກເພື່ອເຂົ້າໃຈເຖິງຄວາມສອດຄ່ອງຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບສະລັບສັບຊ້ອນ H2BFS-HLA-A-HMGA1, ເຊິ່ງຕິດຕາມການສົນທະນາຂ້າມ intramolecular ແລະ intermolecular.Inferences ຈາກຂໍ້ມູນ CLMS ຊີ້ໃຫ້ເຫັນຄວາມເປັນໄປໄດ້ຂອງຄວາມສອດຄ່ອງທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ H2BFS, HLA-A, ແລະ HMGA1.ຄວາມສອດຄ່ອງທີ່ແຕກຕ່າງກັນທີ່ເປັນໄປໄດ້ລະຫວ່າງສະລັບສັບຊ້ອນທາດໂປຼຕີນຈາກ docking ເຫຼົ່ານີ້ເປີດເຜີຍປະຕິສໍາພັນຫຼາຍອັນທີ່ຄ້າຍຄືກັນກັບທີ່ສັງເກດເຫັນໃນຊຸດຂໍ້ມູນ CLMS.ຫນຶ່ງໃນຈຸດແຂງຕົ້ນຕໍຂອງວິທີການຂອງພວກເຮົາແມ່ນວ່າມັນຊ່ວຍໃຫ້ການກໍານົດໄດ້ງ່າຍຂອງການພົວພັນກັບ genes polymorphic ສູງເຊັ່ນ HLA, ສະນັ້ນມັນຫນ້າສົນໃຈທີ່ຈະສຶກສາການໂຕ້ຕອບຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ HLA haplotype ສະເພາະທີ່ມີຄວາມຫຍຸ້ງຍາກໃນການສຶກສາ.ຮ່ວມກັນ, ຂໍ້ມູນຂອງພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ CLMS ສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອຂະຫຍາຍຄວາມເຂົ້າໃຈຂອງພວກເຮົາກ່ຽວກັບເຄືອຂ່າຍສັນຍານ interferon-induced ແລະເປັນພື້ນຖານສໍາລັບການສຶກສາລະບົບ intercellular ທີ່ສັບສົນຫຼາຍໃນສະພາບແວດລ້ອມຈຸນລະພາກ tumor.
ຈຸລັງ Flo-1 ແມ່ນໄດ້ຮັບຈາກ ATCC ແລະຮັກສາໄວ້ໃນ DMEM (Gibco) ເສີມດ້ວຍ 1% penicillin/streptomycin (Invitrogen), 10% ເຊຣັມ bovine fetal (Gibco) ແລະເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ 37 ° C ແລະ 5% CO2.ການອົບ.ຈຸລັງໄດ້ຖືກເຕີບໂຕເຖິງ 70-80% confluence ກ່ອນທີ່ຈະໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ IFNα14 (ຜະລິດໂດຍໂຮງງານຜະລິດທາດໂປຼຕີນຈາກ Edinburgh).ສານເຄມີ ແລະທາດປະສົມອື່ນໆທັງໝົດແມ່ນໄດ້ຊື້ຈາກ Sigma Aldrich ເວັ້ນເສຍແຕ່ໄດ້ລະບຸໄວ້ເປັນຢ່າງອື່ນ.
ຈຸລັງ Flo-1 ໄດ້ຖືກປູກຝັງຢູ່ໃນແຜ່ນ 6 ດີ ແລະໃນມື້ຕໍ່ມາ ຈຸລັງໄດ້ຖືກປະຕິບັດດ້ວຍ IFNα14 10 ng/ml ເປັນເວລາ 24 ຊົ່ວໂມງເຖິງປະມານ 80%.ຈຸລັງຖືກລ້າງສາມເທື່ອດ້ວຍ PBS ແລະຜູກມັດດ້ວຍ DSS (Thermo Fisher Scientific) ທີ່ກຽມໄວ້ໃຫມ່ (ລະລາຍໃນ DMSO) ໃນ PBS ເປັນເວລາ 5 ນາທີຢູ່ທີ່ 37 ° C. ກັບຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນສຸດທ້າຍຂອງ 0.5 mM.ປະຕິກິລິຍາຂ້າມເຊື່ອມຕໍ່ຂອງ DSS ຖືກແທນທີ່ດ້ວຍ PBS ແລະ DSS ທີ່ເຫຼືອຖືກດັບໂດຍການເພີ່ມ 20 mM Tris (pH 8.0) ໃນ PBS ສໍາລັບ 15 ນາທີຢູ່ທີ່ 37 ° C.ຈຸລັງໄດ້ຖືກລວບລວມໂດຍການຂູດແລະລວບລວມຢູ່ໃນທໍ່ທີ່ມີການເຊື່ອມໂຍງຕ່ໍາ (Axygen).
ເມັດຈຸລັງຖືກ lysed ດ້ວຍ 300 µl ຂອງ urea lysis buffer (8 M urea, 0.1 M Tris, pH 8.5) ສໍາລັບ 30 ນາທີຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງດ້ວຍການສັ່ນບາງຄັ້ງ.ຂັ້ນຕອນການສູນພັນທັງໝົດໄດ້ຖືກປະຕິບັດຢູ່ທີ່ 14,000 xg ທີ່ 8 ° C.Centrifuge lysate ສໍາລັບ 10 ນາທີແລະໂອນ supernatant ກັບທໍ່ໃຫມ່.ອະນຸພາກທີ່ຊັດເຈນທີ່ຍັງເຫຼືອໄດ້ຖືກລະລາຍໃນ 150 μlຂອງ lysis buffer ທີສອງ (2 M urea, 2% (w/v) SDS (sodium dodecyl sulfate))) ເປັນເວລາ 30 ນາທີຫຼືຫຼາຍກວ່ານັ້ນຈົນກ່ວາການແກ້ໄຂບັນຫານ້ໍາທີ່ເປັນເນື້ອດຽວກັນ.lysate ຖືກ centrifuged ສໍາລັບ 20 ນາທີແລະ supernatant ໄດ້ຖືກປະສົມກັບ lysate ທີ່ໄດ້ຮັບໃນຂັ້ນຕອນທີ່ຜ່ານມາ.ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງທາດໂປຼຕີນໄດ້ຖືກປະເມີນໂດຍໃຊ້ Micro BCA assay (Thermo Fisher Scientific) ຕາມຄໍາແນະນໍາຂອງຜູ້ຜະລິດສໍາລັບຂັ້ນຕອນ microplate.ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກແຊ່ແຂງຢ່າງໄວວາໃນທາດໄນໂຕຣເຈນຂອງແຫຼວແລະເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ -80 ° C.
ປະມານ 100 μgຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກການເຊື່ອມໂຍງທີ່ລະລາຍໄດ້ຖືກປຸງແຕ່ງໂດຍໃຊ້ໂປໂຕຄອນການກະກຽມຕົວຢ່າງການກັ່ນຕອງທີ່ຖືກດັດແປງ (FASP) ຕາມການອະທິບາຍໂດຍ Wisniewski et al.69 ໂດຍຫຍໍ້, ທາດໂປຼຕີນແມ່ນເຊື່ອມໂຍງຂ້າມກັບ 200 µl ຂອງ urea buffer (8 M urea ໃນ 0.1 M Tris, pH 8.5), vortexed ແລະເຄິ່ງຫນຶ່ງ.ຂັ້ນຕອນການສູນພັນທັງໝົດໄດ້ຖືກປະຕິບັດຢູ່ທີ່ 14,000 xg ທີ່ 25 ° C.ເຄິ່ງທໍາອິດຂອງ lysate ທາດໂປຼຕີນຈາກການເຊື່ອມຕໍ່ຂ້າມໄດ້ຖືກໂອນໄປຫາອຸປະກອນການກັ່ນຕອງ centrifugal 10 kDa Microcon ທີ່ມີ Membrane Ultracel-10 (Merck), ປະຕິບັດຕາມດ້ວຍການ centrifugation ໃນການກັ່ນຕອງ 25 ນາທີ.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ເພີ່ມເຄິ່ງຫນຶ່ງຂອງທາດໂປຼຕີນໃນການກັ່ນຕອງແລະເຮັດຊ້ໍາຂັ້ນຕອນດຽວກັນ.ການຟື້ນຟູທາດໂປຼຕີນແມ່ນປະຕິບັດໂດຍການເພີ່ມ 100 μlຂອງ 17 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) ໃນ urea buffer.ການຟື້ນຕົວໄດ້ຖືກ stirred ສຸດ thermomixer ຢູ່ທີ່ 600 rpm ສໍາລັບ 30 ນາທີຢູ່ທີ່ 37 ° C.ນອກຈາກນັ້ນ, ຖັນໄດ້ຖືກ centrifuged ແລະທາດໂປຼຕີນຈາກການເຊື່ອມໂຍງທີ່ຫຼຸດລົງແມ່ນ alkylated ໂດຍໃຊ້ 100 μlຂອງ 50 mM iodoacetamide ໃນ urea buffer.ປະຕິກິລິຍາ alkylation ໄດ້ຖືກປະຕິບັດຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງສໍາລັບ 20 ນາທີໃນຄວາມມືດ.ໝຸນຖັນ, ລ້າງຝາຖັນ 3 ເທື່ອດ້ວຍ urea buffer 100 µl, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນ centrifuge.ການດໍາເນີນງານດຽວກັນໄດ້ຖືກປະຕິບັດ 3 ເທື່ອໂດຍໃຊ້ 100 μlຂອງ 100 mM ammonium bicarbonate.ກ່ອນທີ່ຈະ trypsinization, ທົດແທນທໍ່ເກັບກໍາດ້ວຍອັນໃຫມ່.ເພີ່ມ buffer ການຍ່ອຍອາຫານທີ່ມີ 50 mM ammonium bicarbonate ແລະ 1 µl trypsin ເຈືອຈາງໃນ trypsin buffer (Promega).ອັດຕາສ່ວນຂອງ trypsin ກັບທາດໂປຼຕີນແມ່ນຮັກສາຢູ່ທີ່ປະມານ 1: 33, ແລະປະຕິກິລິຍາການຍ່ອຍອາຫານໄດ້ຖືກ incubated ຄືນຢູ່ທີ່ 37 ° C. ຢູ່ໃນຫ້ອງທີ່ມີຄວາມຊຸ່ມຊື່ນ.peptide crosslinked ໄດ້ຖືກ eluted ຈາກການກັ່ນຕອງໂດຍການ centrifugation ສໍາລັບ 25 ນາທີ.ການຟື້ນຕົວຂອງ Peptide ໄດ້ຖືກປັບປຸງໂດຍການເພີ່ມ 50 μlຂອງ 0.5 M NaCl ເຂົ້າໄປໃນຕົວກອງ, ຕິດຕາມດ້ວຍ centrifugation ສໍາລັບ 25 ນາທີ.
ຖັນ C18 Micro Spin (Harvard Apparatus) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກໍາຈັດ peptides tryptic ຂ້າມເຊື່ອມຕໍ່ຕາມໂປໂຕຄອນທີ່ອະທິບາຍໂດຍ Bouchal et al.70 ດ້ວຍການດັດແປງເລັກນ້ອຍ.ໂດຍຫຍໍ້, ຖັນ spin C18 ໄດ້ຖືກເປີດໃຊ້ດ້ວຍສາມລ້າງຂອງ 0.1% ອາຊິດ formic (FA) ໃນ acetonitrile (AcN) (Merck) ແລະສອງລ້າງຂອງ 0.1% FA.ຖັນໄດ້ຖືກ hydrated ດ້ວຍ 0.1% FA ສໍາລັບ 15 ນາທີ.ໂຫລດຕົວຢ່າງເຂົ້າໄປໃນຖັນ spin ແລະລ້າງ 3 ເທື່ອດ້ວຍ 0.1% FA.peptides desalted ໄດ້ຖືກ eluted ຕາມລໍາດັບດ້ວຍການ gradient ເປັນຂັ້ນຕອນໂດຍນໍາໃຊ້ 50%, 80% ແລະ 100% AcN ໃນ 0.1% FA.ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກຕາກໃຫ້ແຫ້ງໃນເຄື່ອງເຂັ້ມຂຸ້ນ SpeedVac Plus (Eppendorf) ຈົນກ່ວາຂອງແຫຼວທີ່ເຫຼືອຈະຫາຍໄປຫມົດ.peptides eluted ໄດ້ຖືກລະລາຍໃນ 100 μlຂອງອາຊິດ trifluoroacetic 0.08% ໃນ 2.5% AcN ແລະຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນໄດ້ຖືກວັດແທກຢູ່ໃນ NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).ປະມານ 1 μgຂອງ peptide crosslinked ຕໍ່ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກສັກເຂົ້າໄປໃນລະບົບ LC-MS / MS.
peptides ຂ້າມເຊື່ອມຕໍ່ໄດ້ຖືກແຍກອອກຈາກລະບົບ UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) ທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ກັບເຄື່ອງວັດແທກມະຫາຊົນ Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).peptides ຂ້າມເຊື່ອມຕໍ່ໄດ້ຖືກເກັບກໍາຢູ່ໃນ 300 µm ID, 5 mm ຍາວ µ-pre-column ຖັນ capture C18 packed ກັບ C18 PepMap100 sorbent ແລະ 5 µm PepMap sorbent (Thermo ວິທະຍາສາດ).ໂຫຼດການໄຫຼຂອງປັ໊ມທີ່ກໍານົດໄວ້ຢູ່ທີ່ 5 µl / ນາທີ 0.08% ອາຊິດ trifluoroacetic ທີ່ລະລາຍໃນ 2.5% AcN.peptides ຂ້າມເຊື່ອມຕໍ່ໄດ້ຖືກແຍກຢູ່ໃນຖັນ silica fused ການວິເຄາະທີ່ມີເສັ້ນຜ່າກາງພາຍໃນຂອງ 75 μmແລະຄວາມຍາວຂອງ 150 ມມ, ເຕັມໄປດ້ວຍ sorbent PepMap 2 μm (Thermo ວິທະຍາສາດ).ໄລຍະມືຖື A ແລະ B ປະກອບດ້ວຍ 0.1% FA ໃນນ້ໍາແລະ 0.1% FA ໃນ acetonitrile, ຕາມລໍາດັບ.gradient ເລີ່ມຕົ້ນຢູ່ທີ່ 2.5% B ແລະເພີ່ມຂຶ້ນເປັນເສັ້ນເປັນ 40% B ໃນໄລຍະ 90 ນາທີ, ຫຼັງຈາກນັ້ນເປັນ 90% B ໃນ 2 ນາທີຕໍ່ໄປ.ອົງປະກອບໄລຍະມືຖືຖືກຮັກສາໄວ້ຢູ່ທີ່ 90% B ສໍາລັບ 10 ນາທີແລະຫຼັງຈາກນັ້ນຫຼຸດລົງເປັນເສັ້ນເປັນ 2.5% B ໃນໄລຍະ 2 ນາທີ.ຖັນໄດ້ຖືກສົມດຸນຢູ່ທີ່ 2.5% B ສໍາລັບ 8 ນາທີກ່ອນຮອບວຽນຕໍ່ໄປ.peptides ຂ້າມເຊື່ອມຕໍ່ eluted ຈາກຖັນການວິເຄາະໄດ້ຖືກ ionized ໃນແຫຼ່ງ nanoelectrospray ionization (NSI) ແລະ injected ເຂົ້າໄປໃນ Exploris 480 mass spectrometer (Thermo ວິທະຍາສາດ).
ເຄື່ອງວັດແທກມະຫາຊົນຂອງ Orbitrap Exploris 480 ດໍາເນີນການໃນຮູບແບບການພົວພັນຂໍ້ມູນໃນທາງບວກ.ການສະແກນເຕັມໄດ້ຖືກປະຕິບັດໃນໂຫມດພາກທີ່ຄວາມລະອຽດ 120,000 ດ້ວຍການຕັ້ງຄ່າຊ່ວງຕັ້ງແຕ່ m/z 350 Th ຫາ m/z 2000 Th.ເປົ້າໝາຍ AGC ປົກກະຕິໄດ້ຖືກກໍານົດໄວ້ທີ່ 300% ດ້ວຍເວລາປ້ອນຂໍ້ມູນສູງສຸດ 50ms.ການກວດສອບສູງສຸດ Monoisotopic ໄດ້ຖືກສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນສໍາລັບ peptides.ພາຣາມິເຕີການຜ່ອນຄາຍຂໍ້ຈຳກັດຖືກຕັ້ງເປັນຈິງ ຖ້າພົບຕົວຊີ້ບອກໜ້ອຍເກີນໄປ.ຄວາມເຂັ້ມແຂງ ionic ຕໍາ່ສຸດທີ່ຂອງຄາຣະວາຖືກຕັ້ງເປັນ 5.0e3 ແລະຄ່າຄາຣະວາຂອງຄາຣະວາເຖິງ +8 ໄດ້ຖືກລວມເຂົ້າໃນການທົດລອງ.
ເວລາຮອບວຽນລະຫວ່າງການສະແກນຫຼັກໃນໂຫມດການເຊື່ອມໂຍງຂໍ້ມູນຖືກຕັ້ງເປັນ 2.5 ວິນາທີ.ການຍົກເວັ້ນມະຫາຊົນແບບເຄື່ອນໄຫວໄດ້ຖືກກໍານົດເປັນ 20 s ຫຼັງຈາກ fragmentation ທໍາອິດຂອງ ion precursor.ປ່ອງຢ້ຽມແຍກຄາຣະວາຖືກຕັ້ງເປັນ 2 ທ.ປະເພດຂອງພະລັງງານ collision ປົກກະຕິທີ່ມີຮູບແບບພະລັງງານ collision ຄົງໄດ້ຖືກເລືອກໃນການສະແກນ MS / MS ຂໍ້ມູນ.ພະລັງງານ collision ກໍານົດເປັນ 30%.ການແກ້ໄຂ Orbitrap ໄດ້ຖືກກໍານົດເປັນ 15,000 ແລະເປົ້າຫມາຍ AGC ເປັນ 100%.ເວລາສີດສູງສຸດແບບກຳນົດເອງແມ່ນຕັ້ງເປັນ 60 ມິນລິວິນາທີ.
ກ່ອນທີ່ຈະຕິດຕາມເຄືອຂ່າຍທາດໂປຼຕີນຈາກທາດໂປຼຕີນໃນຕົວຢ່າງທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ກັນ, ພວກເຮົາໄດ້ປຸງແຕ່ງໄຟລ໌ດິບໂດຍໃຊ້ແພັກເກັດ MaxQuant (ຮຸ່ນ 1.6.12.0)26,27 ເພື່ອກໍານົດ peptides / ທາດໂປຼຕີນທີ່ສາມາດຕິດຕາມໄດ້ໃນຕົວຢ່າງ.ນອກຈາກນັ້ນ, ການວິເຄາະ proteomic ທີ່ຄ້າຍຄືກັນໄດ້ຖືກປະຕິບັດຢູ່ໃນຕົວຢ່າງ Flo-1 ທີ່ບໍ່ເຊື່ອມຕໍ່ທີ່ຖືກປະຕິບັດແລະບໍ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ IFNα.ຂໍ້ມູນ MS/MS ໄດ້ຖືກຄົ້ນຫາຢູ່ໃນຖານຂໍ້ມູນມະນຸດຂອງ UniProt (www.uniprot.org) (ອັບໂຫຼດວັນທີ 12 ສິງຫາ 2020, ມີ 75,093 ລາຍການ) ໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງຈັກຄົ້ນຫາ Andromeda27 ທີ່ມີໃນຕົວ.ການຄົ້ນຫາໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍບໍ່ມີການຊີ້ບອກເຖິງຄວາມສະເພາະຂອງ enzyme ແລະການດັດແກ້ຕ່າງໆຂອງ deamidation (N, Q) ແລະການຜຸພັງ (M).ຄວາມທົນທານຂອງມະຫາຊົນ Precursor ໄດ້ຖືກກໍານົດຢູ່ທີ່ 20 ppm ແລະ ions ຜະລິດຕະພັນຢູ່ທີ່ 0.02 Da.ການບ່ຽງເບນຂອງມະຫາຊົນເບື້ອງຕົ້ນ ແລະສູງສຸດແມ່ນຕັ້ງເປັນ 10 ppm.ມະຫາຊົນສູງສຸດຂອງ peptide ໄດ້ຖືກກໍານົດຢູ່ທີ່ 4600 Da ແລະຄວາມຄ້າຍຄືກັນຂອງລໍາດັບແມ່ນຖືກກໍານົດລະຫວ່າງ 7 ແລະ 25 ອາຊິດ amino (aa).ການວິເຄາະສະຖິຕິເພີ່ມເຕີມໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ໂປຼແກຼມ Perseus (ຮຸ່ນ 1.6.10.45).ເນື້ອໃນຂອງທາດໂປຼຕີນໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍການເຮັດໃຫ້ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງທາດໂປຼຕີນເປັນປົກກະຕິ (ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ LFQ; ປະລິມານທີ່ບໍ່ມີປ້າຍຊື່) 27 ແລະຄ່າຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນໄດ້ຖືກປ່ຽນເປັນ Log2.ການຈັດກຸ່ມທາດໂປຣຕີນຕາມລຳດັບທີ່ລະບຸໂດຍຄວາມເຂັ້ມຂອງ peptide ຂອງພວກມັນໄດ້ຖືກສ້າງຂຶ້ນໂດຍໃຊ້ຊຸດ phheatmap (v1.0.12) ໃນ R (v 4.1.2).ການວິເຄາະການເສີມສ້າງທາງເດີນໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ຖານຂໍ້ມູນເສັ້ນທາງ Reactome ສໍາລັບທາດໂປຼຕີນທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວ IFNα ທີ່ມີການກະຕຸ້ນຫຼາຍກ່ວາສີ່ຄັ້ງເມື່ອທຽບກັບຕົວຢ່າງທີ່ບໍ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວ.
ການກໍານົດຕົວເຊື່ອມຕໍ່ທາງເຄມີສະເພາະຂອງ lysine (K) ຫຼື serine (S) ຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກສະລັບສັບຊ້ອນທີ່ຕິດຕາມໂດຍ LC-MS/MS ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງກໍານົດ spectroscopic (SIM-XL) ສໍາລັບ peptides ຂ້າມເຊື່ອມຕໍ່ (SIM-XL)29.ຫນ້າທໍາອິດ, ການໂຕ້ຕອບທີ່ເປັນໄປໄດ້ລະຫວ່າງພັນທຸກໍາຂອງ interferon-associated (IFN) DNA damage resistance signature (IRDS) ໄດ້ຖືກສືບສວນໂດຍໃຊ້ຊຸດຂໍ້ມູນທາດໂປຼຕີນ IRDS ທີ່ອະທິບາຍໄວ້ໃນ Padariya et al.28.ການກວດສອບທຸກເງື່ອນໄຂແລະການເຮັດຊ້ໍາຄືນຂອງ UniProt ຂອງມະນຸດທັງຫມົດແມ່ນມີຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນທາງດ້ານຄອມພິວເຕີ້, ດັ່ງນັ້ນຖານຂໍ້ມູນ UniProt ຂອງມະນຸດທັງຫມົດ (www.uniprot.org) (ດາວໂຫຼດ 12 ສິງຫາ 2020, ມີ 75,093 ລາຍການ) ຕໍ່ກັບການຊໍ້າຄືນທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວ IFNα.ຫນຶ່ງໃນຕົວກອງສໍາລັບການໂຕ້ຕອບຄວາມໄວ້ວາງໃຈສູງ.ການໂຕ້ຕອບທີ່ມີຄວາມສໍາຄັນສູງເຫຼົ່ານີ້ໄດ້ຮັບໄດ້ຖືກຂະຫຍາຍແລະທົດສອບໃນທຸກໆການຄ້າງຫ້ອງແລະເງື່ອນໄຂ.
ໃນ SIM-XL, DSS ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບ crosslinker (XL) ແລະການປ່ຽນແປງນ້ໍາຫນັກ XL ແລະການປ່ຽນແປງນ້ໍາຫນັກແມ່ນຖືກກໍານົດເປັນ 138.06 ແລະ 156.07, ຕາມລໍາດັບ.ສະຖານທີ່ປະຕິກິລິຍາ crosslinking ຕໍ່ໄປນີ້ຖືກພິຈາລະນາ: KK, KS ແລະ KN-TERM, ໂດຍບໍ່ມີ ions ນັກຂ່າວ.ທັງ precursor ແລະ fragment ppm ຖືກຕັ້ງເປັນ 20 ແລະຂອບເຂດ Xrea ຖືກຕັ້ງເປັນ 0.15.Trypsin ໄດ້ຖືກພິຈາລະນາເປັນພິເສດຢ່າງສົມບູນ, ແລະວິທີການ fragmentation C-trap (HCD) ທີ່ມີພະລັງງານສູງໄດ້ຖືກປະຕິບັດ.ເກນການຫຼຸດຜ່ອນ DB ແບບເຄື່ອນໄຫວ XCorr ແລະຈໍານວນ peptides ຕໍາ່ສຸດທີ່ສໍາລັບການຫຼຸດຜ່ອນ DB ແບບເຄື່ອນໄຫວໄດ້ຖືກກໍານົດເປັນ 2.5 ແລະ 2, ຕາມລໍາດັບ.ຕົວກໍານົດການອື່ນໆແມ່ນ: ຄວາມເປັນໄປໄດ້ຂອງ monoisotope ແລະຈຸດສູງສຸດຂອງ coincidence cutoff, ຕ່ໍາສຸດ 4 residues AA ຕໍ່ strand ແລະການຄິດຄ່າ strand ສູງສຸດ, ແລະ 3 maxima ຂອງການແບ່ງປັນພາດໂອກາດນີ້.ຜົນໄດ້ຮັບຂອງແຜນທີ່ 2D stitched ໄດ້ຖືກວິເຄາະໃນ (SIM-XL) ແລະການສະແດງກາຟິກ xQuest28 ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອສ້າງແຜນທີ່ 2D.ການເຊື່ອມໂຍງຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກໂຄງສ້າງຂອງທາດໂປຼຕີນແມ່ນສະຫນອງໃຫ້ຢູ່ໃນ PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, ຮຸ່ນ 2.0 Schrödinger, LLC).
ໂຄງສ້າງຕົວແບບຂອງທາດໂປຼຕີນໄດ້ຖືກສ້າງຂື້ນໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງແມ່ຂ່າຍ Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 ໂດຍໃຊ້ຫຼັກການຂອງການສ້າງແບບຈໍາລອງ homology ແລະການປະຕິບັດ "ວິທີການ Markov ທີ່ເຊື່ອງໄວ້".Phyre2 ສ້າງໂຄງສ້າງແບບຈໍາລອງໂດຍອີງໃສ່ການຈັດລໍາດັບທີ່ມີໂຄງສ້າງທາດໂປຼຕີນທີ່ຮູ້ຈັກ.ສໍາລັບໂປຣຕີນ H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, ແລະ MDN1, ໂຄງສ້າງແມ່ແບບ 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62, ແລະ 6i2665 ຖືກໃຊ້.ນອກຈາກນັ້ນ, ໂຄງສ້າງຂອງ AlphaFold71 MX1, UBP18 ແລະ ROBO1 ຍັງຖືກພິຈາລະນາ.ໂຄງສ້າງທາດໂປຼຕີນໄດ້ຖືກສະແດງເປັນພາບໂດຍໃຊ້ຊຸດ BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) ແລະຊຸດສະພາບແວດລ້ອມການເຮັດວຽກຂອງໂມເລກຸນ (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada).