310 10*1mm ສະແຕນເລດ coiled tubing ອົງປະກອບທາງເຄມີ, ໂດເມນ N-terminal ຂອງ spidroin ປະກອບເປັນ hydrogels ອີງໃສ່ amyloid fibrils ແລະສະຫນອງເວທີສໍາລັບການ immobilization ທາດໂປຼຕີນ.

ຂໍ​ຂອບ​ໃຈ​ທ່ານ​ສໍາ​ລັບ​ການ​ຢ້ຽມ​ຢາມ Nature.com​.ທ່ານກໍາລັງໃຊ້ເວີຊັນຂອງຕົວທ່ອງເວັບທີ່ມີການສະຫນັບສະຫນູນ CSS ຈໍາກັດ.ເພື່ອປະສົບການທີ່ດີທີ່ສຸດ, ພວກເຮົາແນະນຳໃຫ້ທ່ານໃຊ້ບຣາວເຊີທີ່ອັບເດດແລ້ວ (ຫຼືປິດການນຳໃຊ້ໂໝດຄວາມເຂົ້າກັນໄດ້ໃນ Internet Explorer).ນອກຈາກນັ້ນ, ເພື່ອຮັບປະກັນການສະຫນັບສະຫນູນຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ, ພວກເຮົາສະແດງເວັບໄຊທ໌ທີ່ບໍ່ມີຮູບແບບແລະ JavaScript.
ຕົວເລື່ອນສະແດງສາມບົດຄວາມຕໍ່ສະໄລ້.ໃຊ້ປຸ່ມດ້ານຫຼັງ ແລະປຸ່ມຕໍ່ໄປເພື່ອເລື່ອນຜ່ານສະໄລ້, ຫຼືປຸ່ມຄວບຄຸມສະໄລ້ຢູ່ທ້າຍເພື່ອເລື່ອນຜ່ານແຕ່ລະສະໄລ້.

ຂໍ້ມູນຈໍາເພາະ

310 10*1mm ສະແຕນເລດ coiled tubing ຜູ້ສະຫນອງ

ອົງປະກອບທາງເຄມີ

ຄຸນສົມບັດກົນຈັກ

ທາດໂປຼຕີນຈາກຜ້າໄຫມ spider recombinant (spider silk spider) ມີຫຼາຍຄໍາຮ້ອງສະຫມັກທີ່ມີທ່າແຮງໃນການພັດທະນາຂອງ biomaterials ໃຫມ່, ແຕ່ລັກສະນະ multimodal ແລະການລວບລວມຂອງພວກມັນເຮັດໃຫ້ພວກເຂົາຍາກທີ່ຈະໄດ້ຮັບແລະງ່າຍຕໍ່ການນໍາໃຊ້.ໃນທີ່ນີ້ພວກເຮົາລາຍງານວ່າທາດໂປຼຕີນຈາກ spidroin ຂະຫນາດນ້ອຍທີ່ປະສົມປະສານແລະທີ່ສໍາຄັນ, ໂດເມນ N-terminal (NT) ຕົວຂອງມັນເອງສ້າງ hydrogels ສະຫນັບສະຫນູນຕົນເອງແລະໂປ່ງໃສຢ່າງໄວວາຢູ່ທີ່ 37 ° C.ໂປຣຕີນ fusion ປະກອບດ້ວຍ NT ແລະທາດໂປຼຕີນຈາກ fluorescent ສີຂຽວຫຼື purine nucleoside phosphorylase ປະກອບເປັນທາດໂປຼຕີນຈາກ fusion ທີ່ເປັນປະໂຫຍດຢ່າງເຕັມສ່ວນ.ໄຮໂດເຈນ.ຜົນໄດ້ຮັບຂອງພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າທາດໂປຼຕີນຈາກ NT ແລະ fusion ປະສົມໃຫ້ຜົນຜະລິດທີ່ສະແດງອອກສູງແລະໃຫ້ hydrogels ທີ່ມີຄຸນສົມບັດທີ່ຫນ້າສົນໃຈເຊັ່ນ: ຄວາມໂປ່ງໃສ, gelation ໂດຍບໍ່ມີການເຊື່ອມຕໍ່ຂ້າມ, ແລະການ immobilization ໂດຍກົງຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ມີການເຄື່ອນໄຫວທີ່ມີຄວາມຫນາແຫນ້ນສູງ.
ແມງມຸມມີຕ່ອມຜ້າໄຫມຫຼາຍເຖິງເຈັດຊຸດທີ່ແຕກຕ່າງກັນ, ແຕ່ລະຊະນິດຜະລິດເສັ້ນໄຫມສະເພາະ.ເສັ້ນໄໝທັງໝົດ 7 ຊະນິດແມ່ນປະກອບດ້ວຍໂປຣຕີນຈາກເສັ້ນໄໝຈາກແມງມຸມ (spider) ປະມານ 6000 ເສດເຫຼືອຍາວ ແລະ ບັນຈຸມີພື້ນທີ່ເຮັດເລື້ມຄືນກາງຂະໜາດໃຫຍ່ທີ່ອ້ອມຮອບດ້ວຍໂດເມນທີ່ປາຍແຫຼມ N- ແລະ C-terminal (NT ແລະ CT)1,2.ປະເພດຜ້າໄຫມທີ່ໄດ້ຮັບການສຶກສາຢ່າງກວ້າງຂວາງທີ່ສຸດ, ampulla ປະຖົມ, ແມ່ນຜະລິດໂດຍຕ່ອມ ampulla ຕົ້ນຕໍ.ໃນຕ່ອມນີ້, monolayer ຂອງຈຸລັງ epithelial ສັງເຄາະທາດໂປຼຕີນຈາກ spidroin ແລະ secretes ເຂົ້າໄປໃນ lumen ຂອງຕ່ອມ, ບ່ອນທີ່ພວກມັນມີຢູ່ໃນຮູບແບບທີ່ລະລາຍ (doping) ທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສູງທີ່ສຸດ (30-50% w/v)3,4.ການຈັດຕັ້ງແລະການສອດຄ່ອງຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ ampullar spidroin ຕົ້ນຕໍໃນຕ່ອມໄດ້ຖືກໂຕ້ວາທີ, ແຕ່ຫຼັກຖານການທົດລອງສ່ວນໃຫຍ່ຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງການສອດຄ່ອງຂອງ helical ໂດຍທົ່ວໄປແລະ / ຫຼືແບບສຸ່ມແລະໂຄງສ້າງ micellar ຫຼື lamellar5,6,7,8,9,10.ໃນຂະນະທີ່ໂດເມນທີ່ຊໍ້າຊ້ອນຄວບຄຸມຄຸນສົມບັດກົນຈັກຂອງເສັ້ນໃຍຜ້າໄຫມ, ປະກອບເປັນ β-sheet nanocrystals ແລະໂຄງສ້າງ amorphous11,12,13,14,15, end domains regulate ເສັ້ນໃຍຜ້າໄຫມເພື່ອຕອບສະຫນອງຕໍ່ການປ່ຽນແປງຕາມສະພາບຂອງຕ່ອມໄຫມ16,17,18.ໂດຍການຄວບຄຸມການສ້າງເສັ້ນໄຫມ, 19. terminal domains ແມ່ນ evolutionarily ອະນຸລັກແລະຫນ້າທີ່ຂອງມັນອາດຈະເປັນທົ່ວໄປກັບໂປຣຕີນ spidroin ທັງຫມົດ 2,20,21.ໃນລະຫວ່າງການຜ່ານຕ່ອມ, pH ຂອງ spidroin ຫຼຸດລົງຈາກປະມານ 7.6 ຫາ < 5.716 ແລະເພີ່ມຂຶ້ນດ້ວຍ shear ແລະ stretch mediated ໂດຍການເຄື່ອນໄຫວໂດຍຜ່ານທໍ່ແຄບຄ່ອຍໆ.ໃນການແກ້ໄຂ, CT ແມ່ນ α-helical constitutive ຂະຫນານ dimer17, ແຕ່ໃນການຕອບສະຫນອງຕໍ່ pH ຕ່ໍາແລະກໍາລັງ shear, CT unfolds ແລະ switches β-layers16, 17, ອາດຈະເຮັດໃຫ້ beta-layers ໃນເຂດພື້ນທີ່ຊ້ໍາຊ້ອນຂອງ Convert 16. NT ແມ່ນ monomeric ພາຍໃຕ້. ສະພາບທີ່ສະທ້ອນເຖິງເງື່ອນໄຂໃນ lumen ຂອງຕ່ອມແລະໄກ່ເກ່ຍການລະລາຍຂອງ spidroin, ແຕ່ໃນ pH ຫຼຸດລົງ, protonation ຂອງຕ່ອງໂສ້ຂ້າງຄຽງຂອງອາຊິດ carboxylic ນໍາໄປສູ່ການ dimerization ຂອງ NT ທີ່ມີ pKa ປະມານ 6.5, ດັ່ງນັ້ນການສະຖຽນລະພາບຂອງ NT ແລະການແກ້ໄຂ spidroin ໃນຂະຫນາດໃຫຍ່. ປະລິມານ.ເຄືອ​ຂ່າຍ 16,18.ດັ່ງນັ້ນ, NT ມີບົດບາດສໍາຄັນໃນການສ້າງ filament, ປ່ຽນຈາກ monomer ໃນການເຄືອບເປັນ dimer ໃນເສັ້ນໄຍ23,24,25.NT ຍັງຄົງມີນ້ໍາທີ່ລະລາຍສູງແລະເປັນ helical ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂທັງຫມົດທີ່ສຶກສາຈົນເຖິງວັນທີ 16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, ເຊິ່ງໄດ້ດົນໃຈການພັດທະນາຂອງມັນເປັນປ້າຍທີ່ເພີ່ມການລະລາຍສໍາລັບການຜະລິດທາດໂປຼຕີນຈາກ heterologous.
ທາດໂປຼຕີນຈາກຜ້າໄຫມ spider mini recombinant, ປະກອບດ້ວຍຫນຶ່ງ NT, ພາກພື້ນຊ້ໍາອີກຄັ້ງຫນຶ່ງ, CT ຫນຶ່ງ, ແລະ His6 tag (His-NT2RepCT) ສໍາລັບການຊໍາລະລ້າງ, ແມ່ນລະລາຍໃນ buffer ນ້ໍາເປັນທາດໂປຼຕີນຈາກຜ້າໄຫມ spider ພື້ນເມືອງແລະ mimics ລັກສະນະທີ່ສໍາຄັນພື້ນເມືອງຂອງ spider ໄຫມ. .ການຄຸ້ມຄອງ 25.31.His-NT2RepCT ສາມາດຖືກປັ່ນເຂົ້າໄປໃນເສັ້ນໄຍຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງ biomimetic ເຊິ່ງການເຄືອບທີ່ລະລາຍ pH 8 ຖືກ extruded ເຂົ້າໄປໃນອາບນ້ໍາ pH 525,32,33,34,35.ການໝັກທາດປະຕິກອນຊີວະພາບຂອງ E. coli ສະແດງອອກເຖິງ His-NT2RepCT ແລະການປິ່ນປົວຫຼັງການປິ່ນປົວເຮັດໃຫ້ຜົນຜະລິດ > 14 g/L ຫຼັງຈາກການຊໍາລະລ້າງ.ຜົນຜະລິດສູງ, ການລະລາຍສູງ, ແລະການຕອບສະຫນອງທີ່ພຽງພໍຂອງ His-NT2RepCT ຕໍ່ກັບສະພາບທີ່ເປັນກົດແມ່ນໄດ້ມາເຖິງ NT23, 25, 34.
ໃນທີ່ນີ້ພວກເຮົາລາຍງານການສ້າງຕັ້ງຢ່າງໄວວາຂອງ hydrogels ໂປ່ງໃສຈາກທາດໂປຼຕີນຈາກ spidroin recombinant, ລວມທັງ NT ດຽວ, ໂດຍການ incubating ການແກ້ໄຂທາດໂປຼຕີນທີ່ 37 ° C.ໂດຍໃຊ້ thioflavin T fluorescence (ThT), Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) ແລະ transmission electron microscopy (TEM), ພວກເຮົາພົບວ່າໂປຣຕີນ NT ແລະ microspider ມີການປ່ຽນໂຄງສ້າງເປັນ β-sheets ແລະ fibrils ຄ້າຍຄື amyloid. ໃນເວລາທີ່ gels ໄດ້ຖືກສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນ.ນອກຈາກນັ້ນ, ໂປຣຕີນ fusion ຂອງ NT ແລະທາດໂປຼຕີນຈາກ fluorescent ສີຂຽວ (GFP) ຫຼື purine nucleoside phosphorylase (PNP) ປະກອບເປັນ hydrogels ກັບ fragments fusion ທີ່ເປັນປະໂຫຍດຢ່າງເຕັມສ່ວນ.ການສະແດງອອກທີ່ມີຄວາມໄວສູງໃນເຈົ້າພາບ heterologous, ບວກໃສ່ກັບການສ້າງ hydrogels ຢ່າງໄວວາພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂທາງ physiological, ເປີດຄວາມເປັນໄປໄດ້ຂອງການຜະລິດ hydrogels ທີ່ມີຄ່າໃຊ້ຈ່າຍທີ່ມີປະສິດທິພາບທີ່ມີຫນ້າທີ່ວິສະວະກໍາ.
ບໍ່ຄືກັບໂປຣຕີນ spidroin recombinant 36 ທີ່ລາຍງານຫຼາຍທີ່ສຸດ, His-NT2RepCT ມີຄວາມຫມັ້ນຄົງໃນ Tris-HCl buffer ທີ່ pH 8 ແລະສາມາດເຂັ້ມຂຸ້ນໄດ້ເຖິງ 500 mg/mL ໂດຍບໍ່ມີການ precipitation25.ດັ່ງນັ້ນ, ພວກເຮົາແປກໃຈທີ່ພົບວ່າທາດໂປຼຕີນນີ້ປະກອບເປັນ hydrogels ທີ່ຊັດເຈນ, ສະຫນັບສະຫນູນຕົນເອງຢ່າງໄວວາໃນເວລາທີ່ incubated ຢູ່ທີ່ 37 ° C (ຮູບ 1b-d).ການສຶກສາເພີ່ມເຕີມໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ His-NT2RepCT gelation ເກີດຂື້ນໃນໄລຍະຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ກວ້າງຂວາງ (10-300 mg/mL) ແລະວ່າຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນນີ້ມີຄວາມກ່ຽວຂ້ອງກັນກັບເວລາ gelation (ຮູບ 1c ແລະຮູບພາບເສີມ 1).ເພື່ອຊອກຫາວ່າພາກສ່ວນໃດຂອງ His-NT2RepCT ໄກ່ເກ່ຍການສ້າງ hydrogel, ຫຼັງຈາກນັ້ນພວກເຮົາໄດ້ກວດເບິ່ງແຕ່ລະໂດເມນເປັນສ່ວນບຸກຄົນແລະໃນການປະສົມປະສານຕ່າງໆໂດຍໃຊ້ flask inversion assay (ຮູບ 1a, b).ຊິ້ນສ່ວນທີ່ທົດສອບທັງໝົດຂອງ gels ທີ່ປະສົມກັນຄືນມາຈາກສະປາຍໂດຣນ (ໃນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງໂປຣຕີນ 300 ມກ/ມລ) ໃນເວລາໜ້ອຍກວ່າ 1 ຊົ່ວໂມງ, ຍົກເວັ້ນ 2 ເຣບທີ່ຕົກຄ້າງ (ຮູບ 1b).ນີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ NT ແລະ CT ຢ່າງດຽວ, ປະສົມປະສານ, ຫຼືກ່ຽວຂ້ອງກັບການຊ້ໍາກັນ, ສາມາດ gel ຢູ່ທີ່ 37 ° C ແລະວ່າແທັກ His6 ບໍ່ມີຜົນກະທົບຕໍ່ຂະບວນການນີ້ໃນລະດັບທີ່ສໍາຄັນ.ເນື່ອງຈາກແນວຄິດທົ່ວໄປວ່າ NT ເປັນທາດໂປຼຕີນທີ່ລະລາຍໄດ້ສູງແລະມີຄວາມຫມັ້ນຄົງ, ແລະວ່າບົດລາຍງານທີ່ຜ່ານມາຂອງ hydrogels spidroin ປະສົມກັນໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນຜົນກະທົບຂອງ gelation ກັບການປ່ຽນແປງທີ່ສອດຄ່ອງໃນພາກພື້ນຊ້ໍາຊ້ອນແລະ / ຫຼື CTs, NT ຕົວຂອງມັນເອງສາມາດເຮັດໄດ້.ການຄົ້ນພົບ gelation ແມ່ນບໍ່ຄາດຄິດ.ຕາຕະລາງເສີມ 1) 37, 38, 39. ທີ່ຫນ້າສັງເກດ, NT gelled ແລ້ວພາຍໃນ 10 ນາທີທີ່ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ ≥ 300 mg/mL (ຮູບ 1c).ການທົດລອງ inversion vial ທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຕ່າງໆຂອງ NT ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າຢູ່ທີ່ > 50 mg/mL ການແກ້ໄຂ NT gelled ໄວກວ່າ His-NT2RepCT ຢູ່ທີ່ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນທີ່ສອດຄ້ອງກັນ (w / v, ຮູບ 1c).
ການເປັນຕົວແທນຂອງໂຄງສ້າງຂອງ spidroin ຕ່າງໆທີ່ໄດ້ສຶກສາໃນວຽກງານນີ້.b ເວລາເຈວຢູ່ທີ່ 37 °C ສໍາລັບທາດໂປຼຕີນຈາກ spidroin recombinant ຕ່າງໆ (300 mg/mL) ກວດພິສູດໂດຍການປ່ຽນຝາອັດປາກມົດລູກ.CT gel ທັນທີໂດຍບໍ່ມີການຟອກ (<300 mg/mL), 2Rep precipitates (300 mg/mL, ຂະຫນາດ 5 mm).c ເວລາເຈນຂອງ His-NT2RepCT ແລະ NT ຢູ່ທີ່ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ຊີ້ໃຫ້ເຫັນຢູ່ທີ່ 37 ° C.d ຮູບຖ່າຍຂອງ His-NT2RepCT ແລະ NT hydrogels ກັບ spider ແລະຕົວອັກສອນ “NT” ພິມຢູ່ລຸ່ມ, ຕາມລໍາດັບ (ທັງສອງ 200 mg/mL, ຂະຫນາດແຖບ 5 ມມ).
Hydrogels ສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນໂດຍທາດໂປຼຕີນຈາກ spidroin recombinant ຕ່າງໆມີສີທີ່ແຕກຕ່າງກັນເລັກນ້ອຍ, ແລະການສັງເກດການຕາເປົ່າສະແດງໃຫ້ເຫັນລະດັບຄວາມໂປ່ງໃສທີ່ແຕກຕ່າງກັນ (ຮູບ 1b).NT gels ມີຄວາມຊັດເຈນເປັນພິເສດໃນຂະນະທີ່ເຈນອື່ນໆກາຍເປັນ opaque.His-NT2RepCT ແລະ NT gels ໂຍນເຂົ້າໄປໃນທໍ່ຮູບທໍ່ກົມສາມາດເອົາອອກຈາກ mold ໄດ້ intact (ຮູບ 1d).
ເພື່ອທົດສອບວ່າ gel ເຄືອບຜ້າໄຫມ spider ທໍາມະຊາດພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂທີ່ພົບເຫັນໃນປັດຈຸບັນເຮັດໃຫ້ gelation ຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ spidroin recombinant, ການເຄືອບໄດ້ຖືກເກັບກໍາຈາກຕ່ອມ ampulla ຂະຫນາດໃຫຍ່ຂອງ spider ຂົວຊູແອັດ (Larinioides sclopetarius).ການເຄືອບໄດ້ຖືກເກັບຮັກສາໄວ້ໃນ 20 mM Tris-HCl buffer ຢູ່ທີ່ 50 mg/mL (ອີງຕາມນ້ໍາແຫ້ງທີ່ວັດແທກ), ແຕ່ບໍ່ມີການສັງເກດເຫັນ gelation ໃນລະຫວ່າງການ incubation 21 ມື້ຢູ່ທີ່ 37 ° C (ຮູບເສີມ 2a).
ເພື່ອກໍານົດປະລິມານ gels ເຫຼົ່ານີ້, ການວັດແທກ rheological ສາມາດນໍາໃຊ້ເພື່ອສຶກສາຂະບວນການ gelation ແລະກໍານົດຄຸນສົມບັດກົນຈັກໂດຍລວມ.ໂດຍສະເພາະ, ການຕິດຕາມ modulus ການເກັບຮັກສາ (ຄວາມຍືດຫຍຸ່ນ) ຢູ່ໃນອຸນຫະພູມສູງສາມາດໃຫ້ຂໍ້ມູນກ່ຽວກັບອຸນຫະພູມ gelling ເຊັ່ນດຽວກັນກັບຄຸນສົມບັດ viscoelastic ຂອງການເຄືອບ.ການທົດລອງການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງອຸນຫະພູມ (ໂດຍນໍາໃຊ້ 1 ° C / ນາທີຢູ່ທີ່ 25-45 ° C, ອີງຕາມການສຶກສາທີ່ຜ່ານມາໂດຍນໍາໃຊ້ວິທີແກ້ໄຂຫຼັກຊັບຜ້າໄຫມທໍາມະຊາດ) 40,41 ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າໂມດູລີການເກັບຮັກສາຂອງວິທີແກ້ໄຂ His-NT2RepCT ແລະ NT ເພີ່ມຂຶ້ນດ້ວຍອຸນຫະພູມທີ່ເພີ່ມຂຶ້ນ.ເພີ່ມຂຶ້ນ (ຮູບທີ 2 ແລະຮູບ 3 ເພີ່ມເຕີມ).ທີ່ຫນ້າສັງເກດ, ໂມດູນ NT ເລີ່ມຕົ້ນເຕີບໂຕໃນອຸນຫະພູມຕ່ໍາເມື່ອທຽບກັບ His-NT2RepCT, ສອດຄ່ອງກັບເວລາ gel ທີ່ໄວກວ່າທີ່ສັງເກດເຫັນເມື່ອ NT ຖືກ incubated ໂດຍກົງກັບ His-NT2RepCT ທີ່ 37 ° C (ຮູບ 1).ຫຼັງຈາກການຫຼຸດລົງໃນອຸນຫະພູມຕໍ່ມາ, ໂມດູນການເກັບຮັກສາບໍ່ໄດ້ກັບຄືນສູ່ຄ່າຕ່ໍາແລະຍັງຄົງຢູ່ເຫນືອໂມດູນການສູນເສຍ (ເບິ່ງເພີ່ມເຕີມ Fig. 3), ຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງ gelation ຄົງທີ່ irreversible ຄວາມຮ້ອນ.ຫຼັງຈາກ gelation, ໂມດູລ elastic ສຸດທ້າຍຢູ່ລະຫວ່າງ 15 ຫາ 330 kPa ສໍາລັບ His-NT2RepCT hydrogels ທີ່ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ 100–500 mg/mL, ແລະໂມດູລ elastic ສຸດທ້າຍສໍາລັບ NT hydrogels (100–500 mg/mL) ຕັ້ງແຕ່ 2 ຫາ 1400. kPa (ຮູບ , 2 ແລະຂໍ້ມູນ ramp ທີ່ສົມບູນ) ເບິ່ງຕື່ມ Fig. 3).
ການປ່ຽນແປງຂອງອຸນຫະພູມໃນລະຫວ່າງການວັດແທກ His-NT2RepCT (300 mg/mL) ແລະ b NT (300 mg/mL) ດ້ວຍການສັ່ນ.ລູກສອນຊີ້ບອກເຖິງແນວໂນ້ມຂອງອຸນຫະພູມ, ແລະການຮົ່ມທີ່ອ່ອນກວ່າຂອງໂມດູນການເກັບຮັກສາຂໍ້ມູນສະແດງໃຫ້ເຫັນການທົດສອບທີ່ຄ່າຂອງແຮງບິດຕ່ໍາກວ່າອຸປະກອນທີ່ລະບຸໄວ້ໂດຍຜູ້ຜະລິດ, ຊຶ່ງເປັນສາເຫດຂອງສິ່ງລົບກວນເພີ່ມຂຶ້ນ.c ການສະສົມໂມດູນສຸດທ້າຍຂອງ His-NT2RepCT ແລະ NT ຫຼັງຈາກອຸນຫະພູມສູງ (100, 300, ແລະ 500 mg/mL).ການອ່ານໂມດູນທັງຫມົດແມ່ນປະຕິບັດຢູ່ທີ່ຄວາມຖີ່ຂອງ 0.1 Hz.
ເປັນວິທີການທີ່ມີທ່າແຮງສໍາລັບການສືບສວນການປ່ຽນແປງທີ່ສອດຄ່ອງກັບ gelation, ພວກເຮົາໄດ້ບັນທຶກ FTIR spectra ຂອງ His-NT2RepCT ແລະ NT ກ່ອນແລະຫຼັງຈາກ gelation ທີ່ 37 ° C (ຮູບ 3a, b).ຕາມທີ່ຄາດໄວ້, ສະເປກຂອງໂຊລູຊັ່ນ His-NT2RepCT ແລະ NT ກົງກັນກັບໂປຣຕີນທີ່ສະແດງໂຄງສ້າງຮອງຂອງ α-helix/random coil, ມີແຖບທີ່ຊັດເຈນຢູ່ທີ່ 1645 cm-1.ສໍາລັບທັງສອງ hydrogels, gelation ເຮັດໃຫ້ມີການສ້າງຕັ້ງຂອງສອງແຂນຢູ່ໃນແຖບ I ກາງປະມານ 1617 cm-1 ແລະ 1695 cm-1 (ຮູບ 3a, b), ຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງການສ້າງໂຄງສ້າງ antiparallel β-sheet.ການປ່ຽນແປງເຫຼົ່ານີ້ຍັງສາມາດເຫັນໄດ້ຊັດເຈນຢູ່ໃນຕົວອະນຸພັນທີສອງແລະຄວາມແຕກຕ່າງຂອງ gelation spectra (ຕື່ມ Fig. 4b).ສອງແຖບຂອງ NT β-layer ມີຄວາມຊັດເຈນຫຼາຍກ່ວາຂອງ His-NT2RepCT, ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າເນື້ອໃນທັງຫມົດຂອງແຖບ β-layer ໃນ NT hydrogel ແມ່ນສູງກວ່າຂອງ NT2RepCT hydrogel.
ຕົວຊີ້ວັດການດູດຊຶມ FTIR ຂອງ His-NT2RepCT ແລະ b NT (ທັງສອງ 500 mg/mL) ກ່ອນ (ການແກ້ໄຂ) ແລະຫຼັງ (gel) incubation ຢູ່ທີ່ 37°C.c ຮູບພາບ TEM ຂອງ resuspended 50 mg/ml NT2RepCT gels ແລະ d NT.ແຖບຂະຫນາດ 200 nm.e ເສັ້ນຜ່າສູນກາງເສັ້ນໄຍຂອງ His-NT2RepCT ແລະ NT hydrogels.n = 100 fibrils ວັດແທກ, p < 0.0001.ແຖບຄວາມຜິດພາດສະແດງໃຫ້ເຫັນຄວາມບ່ຽງເບນມາດຕະຖານ.ສູນກາງຂອງແຖບຄວາມຜິດພາດແມ່ນຄ່າສະເລ່ຍ.ການທົດສອບ t ທີ່ບໍ່ມີຄູ່ (ສອງຫາງ) ຖືກໃຊ້ສໍາລັບການວິເຄາະສະຖິຕິ.f ThT fluorescence ຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ spidroin ທີ່ປະສົມກັນຫຼາຍຊະນິດ (100 mg/mL) ຢູ່ທີ່ 37 °C ໂດຍບໍ່ມີການສັ່ນ.g ການທົດລອງການໃສ່ເຊື້ອ NT (100 mg/mL) ຈາກ 100 mg/mL NT gel ດ້ວຍ 0%, 5%, 10%, ແລະ 20%.
ການວິເຄາະຂອງ gel ໂດຍໃຊ້ກ້ອງຈຸລະທັດເອເລັກໂຕຣນິກການສົ່ງຜ່ານ (TEM) ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ hydrogel ປະກອບດ້ວຍ fibrils ຄ້າຍຄື amyloid (ຮູບ 3c, 3d).ເສັ້ນໃຍທີ່ປະກອບເປັນ NT ໄດ້ຖືກຍືດອອກ (ເສັ້ນຜ່າກາງ 5–12 nm) ແລະບໍ່ມີສາຂາ, ໃນຂະນະທີ່ເສັ້ນໃຍຂອງລາວ-NT2RepCT ມີຄວາມຍາວສັ້ນກວ່າ ແລະເສັ້ນຜ່າສູນກາງກວ້າງກວ່າ (7–16 nm) (ຮູບ 3e).ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ເຮັດໃຫ້ພວກເຮົາປະຕິບັດຕາມ kinetics ຂອງ fibrosis ໂດຍໃຊ້ thioflavin T (ThT).ສໍາລັບທາດໂປຼຕີນຈາກ Spidroin ທີ່ປະສົມກັນທັງໝົດ, ສັນຍານ fluorescent ເພີ່ມຂຶ້ນເມື່ອຕົວຢ່າງຖືກອົບຢູ່ທີ່ 37 °C (ຮູບ 3f, ເພີ່ມເຕີມ Fig. 5a).ສອດຄ່ອງກັບການຄົ້ນພົບນີ້, ການກວດສອບກ້ອງຈຸລະທັດຂອງ NT ແລະ His-NT2RepCT ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂ gelling ໄດ້ເປີດເຜີຍການເພີ່ມຂື້ນຂອງ fluorescence ThT ທີ່ບໍ່ສັງເກດເຫັນການສະສົມຂອງ ThT-positive ທ້ອງຖິ່ນທີ່ສັງເກດເຫັນ (ຕື່ມ Fig. 5b,c).ການສ້າງເສັ້ນໃຍ ThT-positive ບໍ່ໄດ້ມາພ້ອມກັບການເພີ່ມຂື້ນຂອງ NT ແລະຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງລາວ -NTCT (ຕື່ມ Fig. 5d), ຊຶ່ງຫມາຍຄວາມວ່າເຄືອຂ່າຍຂອງ fibrils ໃນ gel ສາມາດສ້າງໄດ້ໂດຍບໍ່ມີການປະນີປະນອມຄວາມຊັດເຈນຂອງ gel.ການ​ປູກ​ຝັງ​ດ້ວຍ​ການ​ເພີ່ມ​ເສັ້ນ​ໄຍ​ທີ່​ສ້າງ​ຕັ້ງ​ໄວ້​ກ່ອນ​ໃນ​ປະລິມານ​ໜ້ອຍ​ສາມາດ​ເລັ່ງ​ການ​ສ້າງ​ເສັ້ນ​ໄຍ​ຂອງ​ບາງ amyloids42,43,44 ແຕ່​ເພີ່ມ 5%, 10% ຫຼື 20% (w/w) NT ກັບ​ການ​ແກ້​ໄຂ​ຂອງ NT hydrocoagulants.ແກ່ນຜົນ (ຮູບ 3g).ບາງທີນີ້ແມ່ນຍ້ອນຄວາມຈິງທີ່ວ່າ fibrils ໃນ hydrogel ແມ່ນຂ້ອນຂ້າງຄົງທີ່ແລະບໍ່ສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ເປັນເມັດ.
ພຶດຕິກໍາທີ່ບໍ່ຄາດຄິດຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ spidroin recombinant ໃນອຸນຫະພູມສູງ prompted ເພີ່ມເຕີມ nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy ການສຶກສາເພື່ອກໍານົດການປ່ຽນແປງ conformational ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການສ້າງ gel.NMR spectra ຂອງວິທີແກ້ໄຂ His-NT2RepCT ທີ່ບັນທຶກໄວ້ໃນໄລຍະເວລາທີ່ 37 ° C ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ CT ຍັງຖືກພັບບາງສ່ວນ, ໃນຂະນະທີ່ສັນຍານ NT ແລະ 2Rep ໄດ້ຫາຍໄປ (ຮູບ 4a), ແນະນໍາວ່າມັນສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນ NT ແລະ 2Rep ທີ່ຄວບຄຸມບາງສ່ວນຂອງການສ້າງ His- NT2RepCT ໄຮໂດເຈນ.ສັນຍານ CT ຍັງໄດ້ຫຼຸດລົງເຖິງ 20% ຂອງຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນເດີມຂອງມັນ, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ CT ສ່ວນຫຼາຍແມ່ນຄົງທີ່ແລະຖືກລວມເຂົ້າໃນໂຄງສ້າງ hydrogel.ສໍາລັບສ່ວນທີ່ນ້ອຍກວ່າຂອງ CT, ເຊິ່ງເປັນມືຖືຄືກັບຕົວຢ່າງ preincubated ແລະສັງເກດເຫັນດັ່ງນັ້ນໂດຍການແກ້ໄຂ NMR, spectra ຂາດສັນຍານສໍາລັບ 10 ທໍາອິດ residues ໂຄງສ້າງ, ອາດຈະເປັນຍ້ອນການ immobilization ຍາກຂອງສ່ວນທີ່ຕິດຄັດມາຂອງ His-NT2Rep .NMR spectra ຂອງ -state ຂອງ hydrogels -NT2RepCT ເປີດເຜີຍການປະກົດຕົວເດັ່ນຂອງ α-helices ແລະ β-layers ແລະ, ໃນຂອບເຂດຫນ້ອຍ, ການສອດຄ່ອງ coil random (ຮູບ 4b).ການວິເຄາະການປ່ຽນແປງທາງເຄມີຂອງສານຕົກຄ້າງ methionine ທີ່ມີຢູ່ໃນ NT ເທົ່ານັ້ນໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າໂດເມນນີ້ໄດ້ຖືກປ່ຽນເປັນໂຄງສ້າງ β-sheet.ເສັ້ນສະແດງທີ່ຂຶ້ນກັບເວລາຂອງ NT ໃນການແກ້ໄຂໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງການຫຼຸດລົງຂອງຄວາມເຂັ້ມງວດຂອງສັນຍານ (ຮູບ 4c), ແລະ NMR ຂອງລັດແຂງຂອງ NT hydrogels ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການຕົກຄ້າງຂອງ NT ສ່ວນໃຫຍ່ຖືກປ່ຽນເປັນໂຄງສ້າງ β-sheet (ຮູບ 4d).ຄວາມສອດຄ່ອງຂອງ 2Rep ບໍ່ສາມາດກໍານົດແຍກຕ່າງຫາກໄດ້ເນື່ອງຈາກແນວໂນ້ມທີ່ຈະລວບລວມ.ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ລັກສະນະ NMR ຂອງລັດແຂງຂອງ NTCT ແລະ His-NT2RepCT hydrogels ມີລັກສະນະຄ້າຍຄືກັນຫຼາຍ (ຮູບ 4b; ເພີ່ມເຕີມ Fig. 6b), ແນະນໍາວ່າ 2Rep ປະກອບສ່ວນພຽງເລັກນ້ອຍໃນສ່ວນໂຄງສ້າງຂອງໄຮໂດເຈນ His-NT2RepCT.ສໍາລັບ CT hydrogels, α-helices, β-sheets, ແລະໂຄງສ້າງມັດທະຍົມ helical random ໄດ້ຖືກພົບເຫັນວ່າມີຢູ່ (ຮູບການເສີມ 6d).ນີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າບາງສ່ວນຂອງ CT ຍັງຄົງເປັນ α-helices ໃນຂະນະທີ່ບາງສ່ວນກາຍເປັນ β-sheets.ດັ່ງນັ້ນ, ຜົນໄດ້ຮັບຂອງ NMR spectroscopy ແນະນໍາວ່າ NT ມີຄວາມສໍາຄັນສໍາລັບການສ້າງ hydrogel ແລະຍັງຫັນປ່ຽນໄປສູ່ການສອດຄ່ອງ β-sheet ຕາມ fusion ກັບ 2Rep ແລະ CT.ອີງຕາມການນີ້, ພວກເຮົາບໍ່ດົນມານີ້ໄດ້ພົບເຫັນວ່າ amyloid zippers spatial ອາດຈະປະກອບຢູ່ໃນທັງຫມົດຫ້າ helices ຂອງໂດເມນ NT, ແລະ Waltz algorithm ຄາດຄະເນພາກພື້ນ amyloidogenic ໃນ helix 1 (ຮູບ 4e).
2D spectra ຂອງ 15N-HSQC 10 mg/mL ການແກ້ໄຂ His-NT2RepCT ກ່ອນ (ສີຟ້າ) ແລະ 19 ຊົ່ວໂມງຫຼັງຈາກ incubation (ສີແດງ) ທີ່ 37 ° C.ຈຸດສູງສຸດຂ້າມບຸກຄົນໃນສະເປກຕາສີແດງ ແລະ F24, G136, polyA ໃນສະເປກສີຟ້າແມ່ນສະແດງດ້ວຍສັນຍາລັກອາຊິດ amino ຕົວອັກສອນດຽວ ແລະຕົວເລກທີ່ເຫຼືອ.insets ສະແດງໃຫ້ເຫັນການເພິ່ງພາອາໄສຂອງຄວາມເຂັ້ມຂອງສັນຍານຕາມເວລາສໍາລັບ residues ທີ່ເລືອກຈາກໂດເມນ NT, 2Rep, ແລະ CT.b ຄວາມຖີ່ວິທະຍຸ Solid-state (RFDR) ຂອງໄຮໂດເຈນ His-NT2RepCT.ຄວາມສໍາພັນຂອງ Cα/Cβ residues ສັງເກດເຫັນໃນ RFDR spectra ໄດ້ຖືກກໍານົດໂດຍການປຽບທຽບກັບການປ່ຽນແປງທາງເຄມີ peptide ຮູບແບບແລະຄ່າທີ່ໄດ້ມາຈາກສະຖິຕິ 82,83 ແລະໂຄງສ້າງຂັ້ນສອງຂອງພວກເຂົາ.SSB - ແຖບດ້ານຂ້າງທີ່ໝຸນ.c ສະເປກຕາໜຶ່ງມິຕິຂອງ 15N-HSQC 10 mg/mL NT solution ໃນລະຫວ່າງການອົບຢູ່ທີ່ 37°C ເປັນເວລາ 36 ຊົ່ວໂມງ.inset ສະແດງໃຫ້ເຫັນຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ volumetric ທຽບກັບເວລາ.d ສະຖານະ Solid state RFDR spectra ຂອງ NT hydrogels.ການພົວພັນຂອງ Cα/Cβ residues ແລະໂຄງສ້າງຂັ້ນສອງຂອງພວກມັນທີ່ສັງເກດເຫັນໃນ RFDR spectra ແມ່ນຊີ້ໃຫ້ເຫັນ.e ອີງໃສ່ໂປຣໄຟລ໌ NT45.79 fibrillation propensity ຈາກຖານຂໍ້ມູນ Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).ພະລັງງານ Rosetta ຂອງປ່ອງຢ້ຽມການປ່ຽນແປງຂອງຟ້າຜ່າທາງພື້ນທີ່ຂອງ hexapeptide ແມ່ນສະແດງຢູ່ໃນ kcal / mol.ແຖບສີແດງສະແດງເຖິງ hexapeptides ທີ່ມີແນວໂນ້ມຂອງ fibrosis ສູງ (ພະລັງງານ Rosetta ຕ່ໍາກວ່າ -23 kcal / mol; ຂ້າງລຸ່ມນີ້ເສັ້ນຈຸດ).ແຖບສີຂຽວສະແດງເຖິງຊິ້ນສ່ວນທີ່ມີພະລັງງານ Rosetta ເຫນືອລະດັບແລະດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງມີແນວໂນ້ມຫນ້ອຍທີ່ຈະປະກອບເປັນ zippers steric.ຊິ້ນສ່ວນທີ່ມີ proline ໄດ້ຖືກຍົກເວັ້ນຈາກການວິເຄາະ (ໂດຍບໍ່ມີຖັນ).ສີ່ຫຼ່ຽມຈະຕຸລັດຊີ້ໃຫ້ເຫັນພື້ນທີ່ຂອງ amyloidosis ທີ່ຄາດຄະເນໂດຍ Waltz algorithm81 (https://waltz.switchlab.org).ລໍາດັບຂອງສານຕົກຄ້າງອາຊິດ amino ຂອງ NT ແມ່ນຢູ່ເທິງສຸດ, ແລະປະເພດຂອງສານຕົກຄ້າງທີ່ພົບເຫັນຢູ່ໃນໂຄງສ້າງຂັ້ນສອງ β (ຖືກກໍານົດໂດຍ spectroscopy NMR ຂອງລັດແຂງ) ສະແດງໃຫ້ເຫັນເປັນສີແດງ.ຕໍາແໜ່ງຂອງຫ້າ NT α-helices ຖືກກໍານົດເປັນ (H1-H5)28.
ຢູ່ທີ່ pH <6.5, HT dimerizes, ທົນທານຕໍ່ກັບຄວາມຮ້ອນຫຼື urea-induced denaturation18.ເພື່ອອະທິບາຍວ່າ NT dimerization ແລະຄວາມຫມັ້ນຄົງມີຜົນກະທົບແນວໃດຕໍ່ gelation, ວິທີແກ້ໄຂທີ່ມີ 100 mg / ml NT ໄດ້ຖືກຄວບຄຸມຢູ່ທີ່ pH 8, 7, ແລະ 6 ໂດຍໃຊ້ການທົດສອບການປີ້ນກັບ vial.ຕົວຢ່າງ NT incubated ຢູ່ທີ່ pH 8 ແລະ 7 gelled ຫຼັງຈາກ 30 ນາທີທີ່ 37 ° C, ແຕ່ pH 8 gel ຍັງຄົງຈະແຈ້ງ, ໃນຂະນະທີ່ pH 7 gel ສະແດງໃຫ້ເຫັນ precipitate ສັງເກດເຫັນ (ຮູບ 5a).ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ການແກ້ໄຂທີ່ມີ HT ຢູ່ທີ່ pH 6 ບໍ່ໄດ້ປະກອບເປັນເຈນ, ແລະສາມາດເຫັນ precipitate ຂະຫນາດໃຫຍ່ຫຼັງຈາກ 20 ນາທີຢູ່ທີ່ 37 ° C.ນີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ dimers ຕົວເອງແລະ / ຫຼືຄວາມຫມັ້ນຄົງທີ່ສູງຂຶ້ນເມື່ອປຽບທຽບກັບ monomers ປ້ອງກັນບໍ່ໃຫ້ gelation.ການສ້າງຕັ້ງຂອງ precipitate ສໍາລັບ NT ຢູ່ທີ່ pH 7 ແລະ 6 ບໍ່ໄດ້ຄາດຫວັງ, ເນື່ອງຈາກວ່າມັນໄດ້ຖືກລາຍງານວ່າ NT ແມ່ນລະລາຍໃນ 200 mg / ml27, ໄດ້ຢ່າງງ່າຍດາຍ refolds ຫຼັງຈາກ denaturation ຄວາມຮ້ອນ, ແລະຍັງຮັກສາ α-helix ໃນຄ່າຕ່ໍາຂອງ. pH 18. ຄໍາອະທິບາຍທີ່ເປັນໄປໄດ້ສໍາລັບຄວາມແຕກຕ່າງເຫຼົ່ານີ້ແມ່ນວ່າການທົດລອງທີ່ໄດ້ລາຍງານກ່ອນຫນ້ານີ້ໄດ້ຖືກປະຕິບັດຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງຫຼືຕ່ໍາກວ່າ, ຫຼືຢູ່ທີ່ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ຂ້ອນຂ້າງຕໍ່າ.
NT vial inversion test (100 mg/mL) ທີ່ pH 8, 7, 6 ແລະ 154 mM NaCl (pH 8) ຫຼັງຈາກ incubation ຢູ່ທີ່ 37°C.b NT CD spectra ທີ່ມີແລະບໍ່ມີ 154 mM NaF ແລະ 154 mM NaCl, ຕາມລໍາດັບ.Molar ellipticity ຢູ່ 222 nm ຖືກປ່ຽນເປັນອັດຕາສ່ວນຂອງພັບທໍາມະຊາດ.c NT inversion assay (100 mg/mL) NT* (37 °C ແລະ 60 °C), NTA72R (37 °C), ແລະ His-NT-L6 (37 °C ແລະ 60 °C).d CD spectra ຂອງ NT mutants NT*, NTA72R, ແລະ His-NT-L6.Molar ellipticity ຢູ່ 222 nm ຖືກປ່ຽນເປັນອັດຕາສ່ວນຂອງພັບທໍາມະຊາດ.e Inversion ການທົດສອບຂອງ NTFlSp, NTMiSp ແລະຫຼຸດລົງ NTMiSp (100 mg/mL).ແຖບຂະຫນາດ 5 ມມ.f CD spectra ຂອງ NT, NTFlSp, NTMiSp ແລະຫຼຸດລົງ NTMiSp.Molar ellipticity ຢູ່ 222 nm ຖືກປ່ຽນເປັນອັດຕາສ່ວນຂອງພັບທໍາມະຊາດ.Full NT spectra ທີ່ 25 °C ແລະ 95 °C ແມ່ນສະແດງຢູ່ໃນຮູບເພີ່ມເຕີມ 8.
ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງເກືອທາງກາຍະພາບກໍານົດປະຕິສໍາພັນ electrostatic ລະຫວ່າງ NT subunits ແລະການ dimerization ຂອງການໂອນ NT ກັບ pH18 ຕ່ໍາ.ພວກເຮົາພົບວ່າການປະກົດຕົວຂອງ 154 mM NaCl ແລະ NaF ຢ່າງແທ້ຈິງໄດ້ຍັບຍັ້ງ gelation, ຕາມລໍາດັບ (ຮູບ 5a, b; ເພີ່ມເຕີມ Fig. 2b) ແລະວ່າເກືອເຫຼົ່ານີ້ໄດ້ເພີ່ມຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງຄວາມຮ້ອນຂອງ NT monomers (ຮູບ 5b, ເພີ່ມເຕີມ Fig. 8). .ມັນຍັງແນະນໍາວ່າການປັບປຸງຄວາມຫມັ້ນຄົງ, ແທນທີ່ຈະເຮັດໃຫ້ dimerization, ປ້ອງກັນການສ້າງເຈນ.
ເພື່ອຄົ້ນຫາບົດບາດຂອງການເຮັດໃຫ້ທາດໂປຼຕີນຫຼຸດລົງແລະຄວາມຫມັ້ນຄົງໃນ gelation, ພວກເຮົາໄດ້ນໍາໃຊ້ສອງ mutants, NT* ແລະ NTA72R, ເຊິ່ງຍັງຍັງຄົງເປັນ monomeric ທີ່ pH28.30 ຕ່ໍາ.NT* ແມ່ນຕົວປ່ຽນການປີ້ນກັບຄ່າສອງເທົ່າທີ່ການກະຈາຍຄ່າ dipolar ປາກົດຂື້ນຂອງໂມໂນເມີຖືກແປ, ເຊິ່ງປ້ອງກັນການ dimerization ແລະເພີ່ມຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງ monomer ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ.NTA72R ແມ່ນ dipole ທີ່ຄິດຄ່າ, ແຕ່ Arg-ທົດແທນ Ala ຕັ້ງຢູ່ໃນເຂດແດນ dimer, ດັ່ງນັ້ນການກາຍພັນຈະແຊກແຊງການໂຕ້ຕອບຂອງຫນ່ວຍຍ່ອຍທີ່ຈໍາເປັນສໍາລັບການ dimerization.ເມື່ອການອົບຢູ່ທີ່ 37°C, NT* ບໍ່ໄດ້ປະກອບເປັນ hydrogel, ໃນຂະນະທີ່ NTA72R ສ້າງເປັນ gel opaque ເປັນເວລາ 15 ນາທີ (ຮູບ 5c).ເນື່ອງຈາກທັງສອງ NT* ແລະ NTA72R ບໍ່ສາມາດຫຼຸດຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນໄດ້ແຕ່ແຕກຕ່າງກັນໃນຄວາມສະຖຽນຂອງ monomer (ຮູບ 5d), ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນຢ່າງແຂງແຮງວ່າຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງອຸນຫະພູມສູງຈະປ້ອງກັນບໍ່ໃຫ້ NT ຈາກການ gelling.ນີ້ຍັງໄດ້ຮັບການສະຫນັບສະຫນູນໂດຍຄວາມຈິງທີ່ວ່າ HT* ປະກອບເປັນເຈນໃນເວລາທີ່ມັນບໍ່ຫມັ້ນຄົງຢູ່ໃນອຸນຫະພູມສູງ (ຫຼັງຈາກ 8 ນາທີຢູ່ທີ່ 60 ° C; ຮູບ 5c).ມັນໄດ້ຖືກສະແດງໃຫ້ເຫັນກ່ອນຫນ້ານີ້ວ່າເນື້ອໃນທີ່ສູງຂອງ methionine ໃນ NT ເຮັດໃຫ້ມີການພັບຕາມທໍາມະຊາດຂອງມັນແລະການທົດແທນຫົກ Met to Leu (ເອີ້ນວ່າ His-NT-L6) ທີ່ເຂັ້ມແຂງຂອງ monomer NT46.ອີງຕາມການສົມມຸດຕິຖານວ່າຄວາມຍືດຫຍຸ່ນຂອງໂຄງສ້າງແມ່ນຈໍາເປັນສໍາລັບການສ້າງ NT gel, ພວກເຮົາພົບເຫັນວ່າຕົວປ່ຽນແປງທີ່ຫມັ້ນຄົງ His-NT-L6 ບໍ່ gel ຢູ່ທີ່ 37 ° C (ຮູບ 5c, d).ແນວໃດກໍ່ຕາມ, His-NT-L6 ຍັງສ້າງເປັນເຈວເມື່ອອົບຢູ່ 60°C ເປັນເວລາ 60 ນາທີ (ຮູບ 5c).
ຄວາມສາມາດຂອງ NT ໃນການຫັນປ່ຽນເປັນໂຄງສ້າງ β-sheet ແລະ hydrogels ປະກົດວ່ານໍາໃຊ້ກັບບາງໂດເມນ NT ຂອງ spidroin.NTs ຈາກປະເພດຜ້າໄຫມທີ່ແຕກຕ່າງກັນແລະຊະນິດ spider, Trichonephila clavipes (NTFlSp), ສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນ gels ເຖິງວ່າຈະມີເນື້ອໃນ methionine ຂ້ອນຂ້າງຕ່ໍາແລະຄວາມຫມັ້ນຄົງຄວາມຮ້ອນສູງ (ຮູບ 5e, f ແລະຕາຕະລາງເສີມ 2).ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, NT ຈາກ spidroin ໂປຕີນ ampullar ຂະຫນາດນ້ອຍຈາກ Araneus ventricosus (NTMiSp) ທີ່ມີຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງຄວາມຮ້ອນຕ່ໍາແລະເນື້ອໃນ methionine ສູງບໍ່ໄດ້ປະກອບເປັນ hydrogels (ຕາຕະລາງເສີມ 2 ແລະຮູບ 5e, f).ອັນສຸດທ້າຍອາດຈະກ່ຽວຂ້ອງກັບການປະກົດຕົວຂອງພັນທະບັດ disulfide intramolecular29,47.ສອດຄ່ອງ, ເມື່ອພັນທະບັດ disulfide ຂອງ NTMiSp ຖືກຫຼຸດລົງ, ມັນປະກອບເປັນ hydrogel ຫຼັງຈາກ incubation ຢູ່ທີ່ 37 ° C ສໍາລັບ 10 min (ຮູບ 5e).ສະຫຼຸບແລ້ວ, ຄວນສັງເກດວ່າຄວາມຍືດຫຍຸ່ນຂອງໂຄງສ້າງແມ່ນສໍາຄັນ, ແຕ່ບໍ່ແມ່ນເງື່ອນໄຂດຽວສໍາລັບການສ້າງຕັ້ງຂອງເຈນຈາກ NT.ປັດໄຈອື່ນທີ່ອາດຈະມີຄວາມກ່ຽວຂ້ອງແມ່ນແນວໂນ້ມທີ່ຈະປະກອບເປັນເສັ້ນໄຍ amyloid, ແລະການວິເຄາະກັບຖານຂໍ້ມູນ zipper ແລະ Waltz algorithm ໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນຄວາມສໍາພັນລະຫວ່າງຄວາມສາມາດໃນການສ້າງ gels ແລະການປະກົດຕົວຂອງພາກພື້ນ amyloidogenic, ເຊັ່ນດຽວກັນກັບຂອບເຂດຂອງພາກພື້ນທີ່ຄາດຄະເນ. ເພື່ອປະກອບເປັນ zippers steric.ມີຄວາມກ່ຽວຂ້ອງກັນ (ຕາຕະລາງເສີມ 2 ແລະ ຕາຕະລາງເສີມ 9).
ຄວາມສາມາດຂອງ NT ໃນການສ້າງ fibrils ແລະຮູບແບບ gels ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂທີ່ເອື້ອອໍານວຍເຮັດໃຫ້ພວກເຮົາສົມມຸດວ່າ NT fusions ກັບຊິ້ນທາດໂປຼຕີນອື່ນໆຍັງສາມາດປະກອບເປັນ gels ທີ່ມີຫນ້າທີ່ເຕັມທີ່ຂອງຄູ່ຮ່ວມງານ fusion.ເພື່ອທົດສອບນີ້, ພວກເຮົາໄດ້ແນະນໍາທາດໂປຼຕີນຈາກ fluorescent ສີຂຽວ (GFP) ແລະ purine nucleoside phosphorylase (PNP) ຢູ່ທີ່ C-terminus ຂອງ NT, ຕາມລໍາດັບ.ໂປຣຕີນ fusion ທີ່ໄດ້ຮັບຜົນໄດ້ຖືກສະແດງອອກໃນ E. coli ທີ່ມີຜົນຜະລິດສຸດທ້າຍສູງຫຼາຍ (150 mg/L ແລະ 256 mg/L shake flask cultures for His-NT-GFP ແລະ His-NT-PNP, ຕາມລໍາດັບ), ສອດຄ່ອງກັບສິ່ງທີ່ໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນ. ສໍາລັບທາດໂປຼຕີນອື່ນໆ fused ກັບ NT Ref.30. His-NT-GFP (300mg/mL) ແລະ His-NT-PNP (100mg/mL) ທາດໂປຼຕີນ fusion ສ້າງເປັນ gels ຫຼັງຈາກ 2 ຊົ່ວໂມງແລະ 6.5 ຊົ່ວໂມງທີ່ 37 ° C ແລະ, ທີ່ສໍາຄັນ, ສ່ວນ GFP ຍັງຄົງບໍ່ປ່ຽນແປງ.ສັງເກດເຫັນຫຼັງຈາກ gelation, ມີ > 70% ຂອງຄວາມເຂັ້ມ fluorescence ເບື້ອງຕົ້ນທີ່ຍັງເຫຼືອຫຼັງຈາກ gelation (ຮູບ 6a).ເພື່ອວັດແທກກິດຈະກໍາ PNP ໃນການແກ້ໄຂແລະເຈນຂອງລາວ - NT-PNP, ພວກເຮົາຕ້ອງໄດ້ເຈືອຈາງທາດໂປຼຕີນຈາກ fusion ກັບ NT ເພາະວ່າກິດຈະກໍາຂອງ enzymatic ຂອງການກະກຽມອັນບໍລິສຸດແມ່ນຢູ່ນອກຂອບເຂດການກວດສອບຂອງການວິເຄາະຢູ່ທີ່ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ gelling.ເຈນທີ່ສ້າງຂຶ້ນດ້ວຍສ່ວນປະສົມທີ່ມີ 0.01 mg/mL His-NT-PNP ແລະ 100 mg/mL NT ຮັກສາໄວ້ 65% ຂອງກິດຈະກໍາຂອງເອນໄຊເບື້ອງຕົ້ນຂອງຕົວຢ່າງ preincubated (ຮູບ 6b).ເຈນຍັງຄົງ intact ໃນລະຫວ່າງການວັດແທກ (ຕື່ມຮູບ 10).
ຄວາມເຂັ້ມຂອງ fluorescence ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກ່ອນ ແລະຫຼັງການເຈວຂອງ His-NT-GFP (300 mg/mL) ແລະ inverted vial ທີ່ບັນຈຸ His-NT-GFP hydrogel (300 mg/mL) ພາຍໃຕ້ແສງ UV ທີ່ເບິ່ງເຫັນໄດ້.ຈຸດສະແດງໃຫ້ເຫັນການວັດແທກສ່ວນບຸກຄົນ (n = 3), ແຖບຄວາມຜິດພາດສະແດງໃຫ້ເຫັນຄວາມບ່ຽງເບນມາດຕະຖານ.ຄ່າສະເລ່ຍແມ່ນສະແດງຢູ່ໃນໃຈກາງຂອງແຖບຄວາມຜິດພາດ.b ກິດຈະກໍາ PNP ໄດ້ຮັບໂດຍການວິເຄາະ fluorometric ໂດຍໃຊ້ວິທີແກ້ໄຂແລະເຈນທີ່ປະກອບດ້ວຍ NT (100 mg / ml) ແລະສ່ວນປະສົມທີ່ມີ 0.01 mg / ml his-NT-PNP ແລະ 100 mg / ml ເງິນໄຕ້ຫວັນໃຫມ່.inset ສະແດງໃຫ້ເຫັນ vial ປີ້ນກັບ hydrogel ທີ່ປະກອບດ້ວຍ His-NT-PNP (ແຖບຂະຫນາດ 5 ມມ).
ທີ່ນີ້, ພວກເຮົາລາຍງານການສ້າງຕັ້ງຂອງ hydrogels ຈາກ NT ແລະທາດໂປຼຕີນຈາກ spidroin ປະສົມອື່ນໆໂດຍການ incubating ການແກ້ໄຂທາດໂປຼຕີນທີ່ 37 ° C (ຮູບ 1).ພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ gelation ແມ່ນກ່ຽວຂ້ອງກັບການຫັນປ່ຽນ α-helices ເຂົ້າໄປໃນຊັ້ນ β-layers ແລະການສ້າງຕັ້ງຂອງ fibrils ຄ້າຍຄື amyloid (ຮູບ 3 ແລະ 4).ການຄົ້ນພົບນີ້ເປັນເລື່ອງແປກທີ່ຍ້ອນວ່າ NTs ແມ່ນເປັນມັດຫ້າອັນເປັນຮູບກົມເປັນຮູບກົມທີ່ຮູ້ຈັກສໍາລັບການລະລາຍທີ່ສູງທີ່ສຸດ ແລະ ຄວາມໝັ້ນຄົງສູງຢູ່ທີ່ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ > 200 mg/mL ຢູ່ 4°C ເປັນເວລາຫຼາຍມື້27.ນອກຈາກນັ້ນ, NTs ຍັງສາມາດພັບຄືນໄດ້ພາຍຫຼັງການເກີດຄວາມຮ້ອນດ້ວຍຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງໂປຣຕີນຕໍ່າໃນ µM.ອີງຕາມຜົນໄດ້ຮັບຂອງພວກເຮົາ, ການສ້າງ fibril ຮຽກຮ້ອງໃຫ້ມີການປະສົມປະສານຂອງຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ > 10 mg/mL ແລະອຸນຫະພູມສູງເລັກນ້ອຍ (ຮູບ 1).ນີ້ແມ່ນສອດຄ່ອງກັບຄວາມຄິດທີ່ວ່າເສັ້ນໄຍ amyloid ສາມາດປະກອບມາຈາກທາດໂປຼຕີນທີ່ພັບເປັນຮູບກົມເຊິ່ງຢູ່ໃນສະພາບທີ່ແຕກອອກເປັນບາງສ່ວນເນື່ອງຈາກການເຫນັງຕີງຂອງຄວາມຮ້ອນພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂທາງຊີວະວິທະຍາ 48 .ຕົວຢ່າງຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ຜ່ານການປ່ຽນແປງນີ້ລວມມີ insulin49,50, β2-microglobulin, transthyretin ແລະ lysozyme51,52,53.ເຖິງແມ່ນວ່າ NT ເປັນ α-helix ຢູ່ໃນສະພາບເດີມຂອງມັນ, ປະມານ 65% ຂອງຕ່ອງໂສ້ polypeptide ແມ່ນເຫມາະສົມກັບການສ້າງ zipper steric (ຮູບ 4e) 45 .ນັບຕັ້ງແຕ່ monomer ເປັນມືຖື 46 ແບບເຄື່ອນໄຫວ, ມັນສາມາດເປີດເຜີຍພື້ນທີ່ amyloidogenic ທີ່ມີທ່າແຮງເຫຼົ່ານີ້ຢູ່ໃນອຸນຫະພູມປານກາງແລະລະດັບຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນສູງຂອງທາດໂປຼຕີນທັງຫມົດສາມາດບັນລຸຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນທີ່ສໍາຄັນສໍາລັບການສ້າງຕັ້ງ amyloid fibril54.ປະຕິບັດຕາມເຫດຜົນນີ້, ພວກເຮົາພົບເຫັນຄວາມສໍາພັນທາງລົບລະຫວ່າງຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ spidroin ແລະເວລາ gelation (ຮູບ 1c), ແລະຖ້າຄວາມສອດຄ່ອງຂອງ monomeric NT ແມ່ນສະຖຽນລະພາບໂດຍການກາຍພັນ (NT*, His-NT-L6) ຫຼືໂດຍການເພີ່ມເກືອ, ສາມາດປ້ອງກັນການເກີດ. ການສ້າງ hydrogels (ຮູບ 5).
ໃນກໍລະນີຫຼາຍທີ່ສຸດ, ເສັ້ນໄຍ amyloid ຫາຍໄປຈາກການແກ້ໄຂເປັນ precipitate, ແຕ່ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂບາງຢ່າງພວກເຂົາສາມາດສ້າງ hydrogels55,56,57.ເສັ້ນໃຍສ້າງ hydrogel ໂດຍປົກກະຕິມີອັດຕາສ່ວນສູງແລະສ້າງເປັນເຄືອຂ່າຍສາມມິຕິທີ່ຫມັ້ນຄົງໂດຍຜ່ານການ entanglement ໂມເລກຸນ, 55,58 ສອດຄ່ອງກັບຜົນໄດ້ຮັບຂອງພວກເຮົາ.ສໍາລັບການສ້າງ hydrogel ໃນ vitro, ທາດໂປຼຕີນມັກຈະຖືກເປີດເຜີຍຢ່າງເຕັມສ່ວນຫຼືບາງສ່ວນ, ສໍາລັບຕົວຢ່າງ, ໂດຍການສໍາຜັດກັບສານລະລາຍອິນຊີ, ອຸນຫະພູມສູງ (70–90°C) ແລະ/ຫຼື pH ຕໍ່າ (1.5–3.0)59,60,61,62.hydrogels spidroin ທີ່ອະທິບາຍຢູ່ທີ່ນີ້ບໍ່ຮຽກຮ້ອງໃຫ້ມີການປຸງແຕ່ງທີ່ຮຸນແຮງ, ແລະພວກເຂົາຕ້ອງການຕົວແທນການເຊື່ອມໂຍງຂ້າມເພື່ອສະຖຽນລະພາບຂອງ hydrogels.
ມັນໄດ້ຖືກລາຍງານມາກ່ອນຫນ້ານີ້ວ່າ spidroin repeats ແລະ QDs, ເຊິ່ງປະກົດວ່າໄດ້ຮັບການປ່ຽນເບຕ້າແຜ່ນໃນລະຫວ່າງການ spinning ຜ້າໄຫມ, ປະກອບເປັນ hydrogels.ເມື່ອປຽບທຽບກັບຜົນການຄົ້ນພົບຂອງພວກເຮົາ, ເວລາ incubation ແລະ/ຫຼື incubation ອຸນຫະພູມແມ່ນຍາວກວ່າຫຼືສູງກວ່າ, ຕາມລໍາດັບ, ແລະ hydrogels ທີ່ໄດ້ຮັບຜົນມັກຈະເປັນ opaque (ຮູບ 7 ແລະຕາຕະລາງເສີມ 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68. , 69. ນອກເໜືອໄປຈາກເວລາ gel ໄວ, NT hydrogels >300 mg/mL (30%) ດີກວ່າໂປຣຕີນຂອງ spider silk spider recombinant ອື່ນໆທັງໝົດ, ເຊັ່ນດຽວກັນກັບ hydrogels ທໍາມະຊາດເຊັ່ນ: gelatin, alginate (2%), agar (0.5%). ) ແລະ collagen.(0.6%) (ຮູບທີ 7 ແລະຕາຕະລາງເສີມ 1 ແລະ 3) 37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
ເວລາ gel ແລະໂມດູລ elastic ຂອງ hydrogels ໃນການສຶກສານີ້ໄດ້ຖືກປຽບທຽບກັບ hydrogels ທີ່ອີງໃສ່ spidroin ອື່ນໆແລະ hydrogels ທໍາມະຊາດທີ່ເລືອກ.ການອ້າງອິງແມ່ນໃຫ້ພ້ອມກັບຄໍາອະທິບາຍກ່ຽວກັບເງື່ອນໄຂ gelation.APS Ammonium persulfate, ອຸນຫະພູມຫ້ອງ.ຂໍ້ມູນ 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
ແມງມຸມປະກົດວ່າໄດ້ພັດທະນາວິທີການປ້ອງກັນ spidroin ຈາກ gelling ໃນລະຫວ່າງການເກັບຮັກສາ.ເຖິງວ່າຈະມີຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນສູງຂອງທາດໂປຼຕີນໃນຕ່ອມຜ້າໄຫມ, ພື້ນທີ່ຊ້ໍາຊ້ອນຂະຫນາດໃຫຍ່ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບໂດເມນ terminal ຫມາຍຄວາມວ່າຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນທີ່ປາກົດຂື້ນຂອງ NT ແລະ CT ໃນຕ່ອມແມ່ນເທົ່າກັບປະມານ 10-20 mg / ml, ຢູ່ໃນຂອບເຂດຂອງການສຶກສານີ້.ຕ້ອງການສໍາລັບການສັງເກດເຫັນການສ້າງ hydrogel ໃນ vitro.ນອກຈາກນັ້ນ, ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນທີ່ຄ້າຍຄືກັນຂອງເກືອ 16 ໄດ້ສະຖຽນລະພາບ NT, ຄືກັບຕ່ອມໄຫມ (ຮູບ 5b).ຄວາມສອດຄ່ອງຂອງ NT ໄດ້ຖືກສຶກສາໃນ E. coli cytosol ແລະພົບວ່າມີການພັບແຫນ້ນກວ່າເມື່ອກວດເບິ່ງໃນ vitro, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນຕື່ມອີກວ່າເກືອຫຼືປັດໃຈອື່ນໆປ້ອງກັນການລວບລວມຂອງມັນຢູ່ໃນ vivo.ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ຄວາມສາມາດຂອງ NTs ທີ່ຈະປ່ຽນເປັນເສັ້ນໄຍ β-sheet ອາດຈະມີຄວາມສໍາຄັນຕໍ່ການສ້າງ filament ແລະຄວນໄດ້ຮັບການສືບສວນໃນການສຶກສາໃນອະນາຄົດ.
ນອກເຫນືອໄປຈາກລັກສະນະໃຫມ່ຂອງ fibril ຄ້າຍຄື NT-amyloid ແລະການສ້າງ hydrogel ສັງເກດເຫັນໃນການສຶກສານີ້, ພວກເຮົາຍັງສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າປະກົດການນີ້ອາດຈະມີການນໍາໃຊ້ທາງຊີວະພາບແລະຊີວະວິທະຍາ (ຮູບ 8).ເປັນຫຼັກຖານສະແດງແນວຄວາມຄິດ, ພວກເຮົາໄດ້ລວມ NT ກັບ GFP ຫຼື PNP ແລະສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າທາດໂປຼຕີນຈາກ fusion ຍັງປະກອບເປັນ hydrogels ເມື່ອ incubated ຢູ່ທີ່ 37 ° C ແລະວ່າສ່ວນ GFP ແລະ PNP ສ່ວນໃຫຍ່ຈະຮັກສາກິດຈະກໍາຂອງເຂົາເຈົ້າຫຼັງຈາກ gelation (ຮູບ 6).Nucleoside phosphorylases ແມ່ນການສັງເຄາະ catalysts ທີ່ສໍາຄັນຂອງ nucleoside analogues75, ເຊິ່ງເຮັດໃຫ້ການຄົ້ນພົບຂອງພວກເຮົາກ່ຽວຂ້ອງກັບອຸດສາຫະກໍາ biopharmaceutical.ແນວຄວາມຄິດຂອງການສະແດງອອກທາດໂປຼຕີນຈາກ fusion ທີ່ປະກອບເປັນ hydrogels ໂປ່ງໃສພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂທີ່ເອື້ອອໍານວຍອະນຸຍາດໃຫ້ການສ້າງ hydrogels ປະຕິບັດຫນ້າທີ່ມີຄຸນສົມບັດທີ່ເອື້ອອໍານວຍສໍາລັບລະດັບຄວາມກ້ວາງຂອງການນໍາໃຊ້ເຊັ່ນ: immobilization enzyme, ການຄວບຄຸມການປ່ອຍຢາແລະວິສະວະກໍາເນື້ອເຍື່ອ.ນອກຈາກນັ້ນ, NT ແລະ NT* ແມ່ນເຄື່ອງຫມາຍການສະແດງອອກທີ່ມີປະສິດທິພາບ 30, ຊຶ່ງຫມາຍຄວາມວ່າ NT ແລະຕົວແປຂອງມັນສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການຜະລິດທາດໂປຼຕີນຈາກ fusion ທີ່ລະລາຍແລະການສ້າງທາດໂປຼຕີນຈາກເປົ້າຫມາຍ immobilized ຕໍ່ມາໃນ 3D hydrogels.
NT ແມ່ນລະລາຍ, α-helical ແລະມີຄວາມຫມັ້ນຄົງຢູ່ທີ່ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຕ່ໍາ (µM) ແລະ 37 ° C.ໃນອຸນຫະພູມດຽວກັນ, ແຕ່ຢູ່ທີ່ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນເພີ່ມຂຶ້ນ (> 10 ມລກ / ມລ), NT ປະກອບເປັນ gels ປະກອບດ້ວຍ fibrils ຄ້າຍຄື amyloid.ທາດໂປຼຕີນ NT fusion ຍັງປະກອບເປັນ gels fibrillar ທີ່ມີ fragments fusion ທີ່ເປັນປະໂຫຍດຢ່າງເຕັມສ່ວນ, ອະນຸຍາດໃຫ້ທາດໂປຼຕີນຕ່າງໆຖືກ immobilized ໃນ hydrogels 3D ໂດຍໃຊ້ NT.ລຸ່ມສຸດ: NT (PDB: 4FBS) ແລະຮູບປະກອບຂອງເຄືອຂ່າຍເສັ້ນໄຍ ແລະໂຄງສ້າງໂປຣຕີນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງ (ສົມມຸດ ແລະບໍ່ໄດ້ແຕ້ມຕາມຂະໜາດ, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210J/pdb4).
ໂຄງສ້າງ (ເບິ່ງຕາຕະລາງເສີມ 4 ສໍາລັບບັນຊີລາຍຊື່ຄົບຖ້ວນລວມທັງລໍາດັບອາຊິດ amino) ຖືກໂຄນເຂົ້າໄປໃນ plasmid pT7 ແລະປ່ຽນເປັນ E. coli BL21 (DE3).E. coli ທີ່ບັນຈຸ plasmids ທີ່ຖືກວິສະວະກໍາໄດ້ຖືກນໍາໄປໃສ່ໃນນ້ໍານົມ Luria ເສີມດ້ວຍ kanamycin (70 mg/l) ແລະເຕີບໂຕຄືນທີ່ 30 ° C ແລະ 250 rpm.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ວັດທະນະທໍາໄດ້ຖືກ inoculated 1/100 ເຂົ້າໄປໃນ LB ຂະຫນາດກາງທີ່ມີ kanamycin ແລະວັດທະນະທໍາທີ່ 30 ° C ແລະ 110 rpm ຈົນກ່ວາ OD600 ບັນລຸ 0.8.ສໍາລັບການສຶກສາ NMR, ເຊື້ອແບັກທີເຣັຍໄດ້ຖືກປູກຢູ່ໃນຂະຫນາດກາງຫນ້ອຍ M9 ທີ່ມີ 2 g ຂອງ D-glucose 13C (Aldrich) ແລະ 1 g ຂອງ ammonium chloride 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) ສໍາລັບການຕິດສະຫຼາກທາດໂປຼຕີນທີ່ມີ isotopes.ຫຼຸດອຸນຫະພູມລົງຢູ່ທີ່ 20 ອົງສາເຊນຊຽດ ແລະກະຕຸ້ນການສະແດງອອກຂອງທາດໂປຼຕີນດ້ວຍ 0.15 mM isopropylthiogalactopyranoside (ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສຸດທ້າຍ).ຫຼັງ​ຈາກ​ການ​ສະ​ແດງ​ອອກ​ທາດ​ໂປຼ​ຕີນ​ໃນ​ຄືນ​, ຈຸ​ລັງ​ໄດ້​ຖືກ​ເກັບ​ກ່ຽວ​ທີ່ 7278 × g​, 4°C ສໍາ​ລັບ 20 ນາ​ທີ​.ເມັດເມັດໄດ້ຖືກຢຸດຄືນໃຫມ່ໃນ 20 mM Tris-HCl, pH 8, ແລະແຊ່ແຂງຈົນກ່ວາການນໍາໃຊ້ຕໍ່ໄປ.ເຊລທີ່ thawed ໄດ້ຖືກ lysed ໂດຍໃຊ້ cell disruptor (TS series machines, Constant Systems Limited, England) ທີ່ 30 kPa.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, lysates ໄດ້ centrifuged ຢູ່ທີ່ 25,000 g ສໍາລັບ 30 ນາທີທີ່ 4 ° C.ສໍາລັບ NTMiSp, ເມັດໄດ້ຖືກຢຸດຄືນໃຫມ່ໃນ 2 M urea, 20 mM Tris-HCl, pH 8, ແລະ sonicated ສໍາລັບ 2 min (2 s on/off, 65%), ຫຼັງຈາກນັ້ນ centrifuged ອີກເທື່ອຫນຶ່ງຢູ່ທີ່ 25,000 xg, 4 ° C. ພາຍໃນ. 30 ນທ.supernatant ໄດ້ຖືກບັນຈຸໃສ່ຖັນ Ni-NTA, ລ້າງດ້ວຍ 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazole, pH 8, ແລະສຸດທ້າຍທາດໂປຼຕີນໄດ້ຖືກ eluted ດ້ວຍ 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazole, pH 8. ເພື່ອສ້າງ NT2RepCT ແລະ NTCT, ການຍ່ອຍອາຫານ thrombin ແນະນໍາສະຖານທີ່ (ThrCleav) ລະຫວ່າງລາວແລະ NT.Thrombin cleavage sites ຍັງມີຢູ່ໃນ His-NT-ThrCleav-2Rep (ຜະລິດ 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (ຜະລິດ NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (ຜະລິດ CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (ຜະລິດ NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (ຜະລິດ NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (ຜະລິດ NTF1Sp), ແລະ His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (ຜະລິດ NTMiSp).ໂຄງສ້າງໄດ້ຖືກຍ່ອຍສະຫຼາຍດ້ວຍ thrombin (1:1000) ແລະ dialyzed ຂ້າມຄືນຢູ່ທີ່ 4 ° C. ດ້ວຍ 20 mM Tris-HCl, pH 8, ໂດຍໃຊ້ Spectra/Por dialysis membrane ທີ່ມີລະດັບນ້ໍາຫນັກໂມເລກຸນຂອງ 6-8 kDa.ຫຼັງຈາກ dialysis, ການແກ້ໄຂແມ່ນ loaded ໃສ່ຖັນ Ni-NTA ແລະ effluent ທີ່ມີທາດໂປຼຕີນທີ່ມີຄວາມສົນໃຈແມ່ນເກັບກໍາ.ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງທາດໂປຼຕີນແມ່ນຖືກກໍານົດໂດຍການວັດແທກການດູດຊຶມ UV ຢູ່ 280 nm ໂດຍໃຊ້ຕົວຄູນການສູນພັນຂອງແຕ່ລະທາດໂປຼຕີນ, ຍົກເວັ້ນ NTF1Sp, ເຊິ່ງໃຊ້ Bradford assay ອີງຕາມໂປໂຕຄອນຂອງຜູ້ຜະລິດ.ຄວາມບໍລິສຸດແມ່ນຖືກກໍານົດໂດຍ SDS polyacrylamide (4-20%) gel electrophoresis ແລະ Coomassie brilliant blue staining.ທາດໂປຼຕີນແມ່ນເຂັ້ມຂຸ້ນໂດຍໃຊ້ຕົວກອງ centrifuge (VivaSpin 20, GE Healthcare) ຢູ່ທີ່ 4000 xg ດ້ວຍການຕັດນ້ໍາຫນັກໂມເລກຸນ 10 kDa ໃນຮອບວຽນ 20 ນາທີ.
ແຊ່ທາດໂປຼຕີນຈາກທາດໂປຼຕີນແລະທໍ່ 150 µl ຢ່າງລະມັດລະວັງເຂົ້າໄປໃນ 1 ml septum vial ຈະແຈ້ງ (8 x 40 mm Thermo Scientific).ທໍ່ໄດ້ຖືກຫຸ້ມແລະປະທັບຕາດ້ວຍ parafilm ເພື່ອປ້ອງກັນການລະເຫີຍ.ຕົວຢ່າງ (n = 3) ໄດ້ຖືກອົບຢູ່ທີ່ 37 ° C ຫຼື 60 ° C ແລະ inverted ເປັນໄລຍະໆເພື່ອສັງເກດການ gelation.ຕົວຢ່າງທີ່ບໍ່ໄດ້ gel ແມ່ນ incubated ຢ່າງຫນ້ອຍຫນຶ່ງອາທິດ.ຫຼຸດພັນທະບັດ NTMiSp disulfide ດ້ວຍ 10 mM DTT ຕໍ່ໂປຣຕີນ 10 µM.ເພື່ອວິເຄາະ gelation ຂອງການເຄືອບຜ້າໄຫມ spider ທໍາມະຊາດ, spider ຂົວຂອງຊູແອັດໄດ້ຖືກຕັດ, ສອງຕ່ອມ ampullated ຕົ້ນຕໍໄດ້ຖືກວາງໄວ້ໃນ 200 μlຂອງ 20 mM Tris-HCl buffer pH 8 ແລະຕັດເພື່ອໃຫ້ການເຄືອບແຍກອອກຈາກຕ່ອມ..ເນື້ອໃນຂອງຕ່ອມໄດ້ຖືກລະລາຍໃນ buffer, 50 µl ສໍາລັບກໍານົດນ້ໍາແຫ້ງ (ໂດຍການ incubation ຂອງ vials ເປີດຢູ່ທີ່ 60 ° C ກັບນ້ໍາຄົງທີ່) ແລະ 150 µl ສໍາລັບ gelation ຢູ່ທີ່ 37 ° C.
ເລຂາຄະນິດ / ເຄື່ອງມືວັດແທກແມ່ນເຮັດດ້ວຍສະແຕນເລດໂດຍໃຊ້ແຜ່ນຂະຫນານທີ່ມີເສັ້ນຜ່າກາງດ້ານເທິງ 20 ມມແລະຊ່ອງຫວ່າງ 0.5 ມມ.ໃຫ້ຄວາມຮ້ອນຕົວຢ່າງຈາກ 25 ° C ຫາ 45 ° C ແລະກັບຄືນໄປບ່ອນ 25 ° C ໃນອັດຕາ 1 ° C ຕໍ່ນາທີໂດຍໃຊ້ແຜ່ນ Peltier ດ້ານລຸ່ມສະແຕນເລດ.ການວັດແທກການສັ່ນສະເທືອນໄດ້ຖືກປະຕິບັດຢູ່ທີ່ຄວາມຖີ່ຂອງ 0.1 Hz ແລະໃນພາກພື້ນ viscoelastic ເສັ້ນຊື່ຂອງວັດສະດຸທີ່ມີສາຍພັນ 5% ແລະ 0.5% ສໍາລັບຕົວຢ່າງຂອງ 100 mg / mL ແລະ 300-500 mg / mL, ຕາມລໍາດັບ.ໃຊ້ຫ້ອງຄວາມຊຸ່ມຊື່ນແບບກຳນົດເອງເພື່ອປ້ອງກັນການລະເຫີຍ.ຂໍ້ມູນຖືກວິເຄາະໂດຍໃຊ້ Prism 9.
ສໍາ​ລັບ​ການ​ເກັບ​ກໍາ infrared (IR​) spectra ໃນ​ອຸນ​ຫະ​ພູມ​ຫ້ອງ​ຈາກ 800 ຫາ 3900 ຊ​ມ​-1​.ອຸປະກອນ ATR, ເຊັ່ນດຽວກັນກັບເສັ້ນທາງແສງສະຫວ່າງຜ່ານ spectrometer, ໄດ້ຖືກ purged ດ້ວຍອາກາດການກັ່ນຕອງແຫ້ງກ່ອນແລະໃນລະຫວ່າງການທົດລອງ.ວິທີແກ້ໄຂ (500 mg/mL ເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນຈຸດສູງສຸດຂອງການດູດຊຶມນ້ໍາໃນ spectra) ໄດ້ຖືກທໍ່ໃສ່ໄປເຊຍກັນ, ແລະ gels (500 mg/mL) ໄດ້ຖືກສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນກ່ອນທີ່ຈະວັດແທກແລະຫຼັງຈາກນັ້ນໂອນໄປເຊຍກັນ (n = 3).ການສະແກນ 1000 ໄດ້ຖືກບັນທຶກໄວ້ດ້ວຍຄວາມລະອຽດ 2 cm-1 ແລະຮອບວຽນຫນ້າທີ່ເປັນສູນຂອງ 2. ອະນຸພັນທີສອງຖືກຄິດໄລ່ໂດຍໃຊ້ OPUS (Bruker) ໂດຍໃຊ້ລະດັບຄວາມລຽບຂອງເກົ້າຈຸດ.spectra ໄດ້​ຖືກ​ປັບ​ໃຫ້​ເປັນ​ປົກ​ກະ​ຕິ​ກັບ​ພາກ​ພື້ນ​ການ​ເຊື່ອມ​ໂຍງ​ດຽວ​ກັນ​ລະ​ຫວ່າງ 1720 ແລະ 1580 cm-1 ໂດຍ​ນໍາ​ໃຊ້ F. Menges “Spectragryph – Optical Spectroscopy Software”.ໃນ ATR-IR spectroscopy, ຄວາມເລິກເຈາະຂອງ beam infrared ເຂົ້າໄປໃນຕົວຢ່າງແມ່ນຂຶ້ນກັບ wavenumber, ເຮັດໃຫ້ການດູດຊຶມທີ່ເຂັ້ມແຂງຢູ່ໃນ wavenumbers ຕ່ໍາກວ່າ wavenumber ສູງ.ຜົນກະທົບເຫຼົ່ານີ້ບໍ່ໄດ້ຮັບການແກ້ໄຂສໍາລັບ spectra ທີ່ສະແດງຢູ່ໃນຮູບ.3 ເນື່ອງຈາກວ່າພວກມັນມີຂະຫນາດນ້ອຍຫຼາຍ (ຮູບພາບເສີມ 4).ສະເປັກທີ່ຖືກແກ້ໄຂສຳລັບຕົວເລກນີ້ຖືກຄຳນວນໂດຍໃຊ້ຊອບແວ Bruker OPUS.
ໃນຫຼັກການ, ການກໍານົດປະລິມານທີ່ສົມບູນແບບຂອງຄວາມສອດຄ່ອງຂອງທາດໂປຼຕີນແມ່ນເປັນໄປໄດ້ຫຼັງຈາກ deconvolution ທີ່ເຊື່ອຖືໄດ້ຂອງອົງປະກອບພາຍໃນ amide I ສູງສຸດ.ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ອຸປະສັກບາງຢ່າງເກີດຂື້ນໃນການປະຕິບັດ.ສິ່ງລົບກວນຢູ່ໃນສະເປກທຣັມສາມາດປາກົດເປັນຈຸດສູງສຸດ (ບໍ່ຖືກຕ້ອງ) ໃນລະຫວ່າງການ deconvolution.ນອກຈາກນັ້ນ, ຈຸດສູງສຸດເນື່ອງຈາກການບິດນ້ໍາ coincides ກັບຕໍາແຫນ່ງຂອງ amide I peak ແລະອາດຈະມີຄວາມຄ້າຍຄືກັນສໍາລັບຕົວຢ່າງທີ່ມີປະລິມານນ້ໍາຫຼາຍ, ເຊັ່ນ: gel aqueous ໄດ້ສຶກສາຢູ່ທີ່ນີ້.ດັ່ງນັ້ນ, ພວກເຮົາບໍ່ໄດ້ພະຍາຍາມທີ່ຈະ decompose ສູງສຸດ amide I ຢ່າງສົມບູນ, ແລະການສັງເກດການຂອງພວກເຮົາຄວນໄດ້ຮັບການພິຈາລະນາພຽງແຕ່ໃນການສະຫນັບສະຫນູນວິທີການອື່ນໆເຊັ່ນ NMR spectroscopy.
ການແກ້ໄຂຂອງ 50 mg/ml NT ແລະ His-NT2RepCT ໄດ້ຖືກແຊ່ຄ້າງຄືນທີ່ອຸນຫະພູມ 37 ອົງສາ.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ໄຮໂດເຈນໄດ້ຖືກເຈືອຈາງດ້ວຍ 20 mM Tris-HCl (pH 8) ກັບຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ 12.5 mg / ml, ສັ່ນໃຫ້ດີແລະທໍ່ເພື່ອທໍາລາຍເຈນ.ຕໍ່ໄປ, hydrogel ໄດ້ຖືກເຈືອຈາງ 10 ເທື່ອດ້ວຍ 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μlຂອງຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ກັບຕາຂ່າຍໄຟຟ້າທອງແດງທີ່ເຄືອບດ້ວຍ formvar, ແລະຕົວຢ່າງທີ່ເກີນໄດ້ຖືກໂຍກຍ້າຍອອກດ້ວຍເຈ້ຍ blotting.ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກລ້າງສອງຄັ້ງດ້ວຍນ້ໍາ 5 µl ຂອງ MilliQ ແລະຖືກຍ້ອມດ້ວຍຮູບແບບ uranyl 1% ເປັນເວລາ 5 ນາທີ.ເອົາຮອຍເປື້ອນສ່ວນເກີນອອກດ້ວຍກະດາດດູດຊຶມ, ຫຼັງຈາກນັ້ນເຮັດໃຫ້ຕາຫນ່າງແຫ້ງ.ການຖ່າຍຮູບໄດ້ຖືກປະຕິບັດຢູ່ໃນຕາຂ່າຍໄຟຟ້າເຫຼົ່ານີ້ໂດຍໃຊ້ FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN ປະຕິບັດການຢູ່ທີ່ 100 kV.ຮູບພາບຕ່າງໆໄດ້ຖືກບັນທຶກໄວ້ໃນຄວາມກວ້າງ x 26,500 ແລະ x 43,000 ໂດຍໃຊ້ກ້ອງຖ່າຍຮູບ Veleta 2k × 2k CCD (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, ເຢຍລະມັນ).ສໍາລັບແຕ່ລະຕົວຢ່າງ (n = 1), 10-15 ຮູບພາບໄດ້ຖືກບັນທຶກໄວ້.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການວິເຄາະຮູບພາບແລະການວັດແທກເສັ້ນຜ່າກາງຂອງເສັ້ນໄຍ (n = 100, ເສັ້ນໄຍທີ່ແຕກຕ່າງກັນ).Prism 9 ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອເຮັດການທົດສອບ t-test ທີ່ບໍ່ມີຄູ່ (ສອງຫາງ).ສະເລ່ຍ His-NT2RepCT ແລະ NT fibrils ແມ່ນ 11.43 (SD 2.035) ແລະ 7.67 (SD 1.389) nm, ຕາມລໍາດັບ.ໄລຍະຄວາມເຊື່ອໝັ້ນ (95%) ແມ່ນ -4.246 ຫາ -3.275.ອົງສາເສລີພາບ = 198, p < 0.0001.
80 µl ຂອງຕົວຢ່າງຂອງແຫຼວທີ່ມີ 10 µM thioflavin T (ThT) ຖືກວັດແທກເປັນ triplicate (n = 3) ພາຍໃຕ້ສະພາບຄົງທີ່ໂດຍໃຊ້ Corning 96-well black clear bottom plates (Corning Glass 3881, USA).ຄວາມແຕກຕ່າງຂອງ fluorescence ໄດ້ຖືກບັນທຶກໄວ້ໂດຍໃຊ້ຕົວກອງຄວາມຕື່ນເຕັ້ນ 440 nm ແລະການກັ່ນຕອງການປ່ອຍອາຍພິດ 480 nm (FLUOStar Galaxy ຈາກ BMG Labtech, Offenburg, ເຢຍລະມັນ).ສັນຍານ ThT ບໍ່ໄດ້ອີ່ມຕົວ ຫຼື ດັບ, ຍ້ອນວ່າການທົດລອງທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ ThT ທີ່ແຕກຕ່າງກັນໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍບໍ່ມີການປ່ຽນແປງຄວາມເຂັ້ມຂອງສັນຍານ.ບັນທຶກການດູດຊຶມຢູ່ທີ່ 360 nm ສໍາລັບການວັດແທກ haze.ສໍາລັບການທົດລອງແກ່ນ, 100 mg/mL gels ໄດ້ຖືກສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນຢູ່ທີ່ 37 ° C., resuspended, ແລະນໍາໃຊ້ສໍາລັບການແກ່ນໃນອັດຕາສ່ວນ molar ຂອງ 5%, 10%, ແລະ 20%.ຂໍ້ມູນຖືກວິເຄາະໂດຍໃຊ້ Prism 9.
ຖິ້ມສະຕັອກຂອງ His-NT2RepCT ແລະ NT >100 mg/mL ໃສ່ນ້ຳກ້ອນ ແລະການກັ່ນຕອງຜ່ານການກັ່ນຕອງ 0.22 µm.ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍການວັດແທກການດູດຊຶມຢູ່ທີ່ 280 nm ໂດຍໃຊ້ Nanodrop.ໃນນໍ້າສ້າງຂອງແຜ່ນສີດໍາທີ່ບໍ່ຜູກມັດ 96 ດີ (Corning) ທີ່ມີດ້ານລຸ່ມຊັດເຈນ, ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກເຈືອຈາງເປັນ 20 mg/ml ໃນ 20 mM Tris-HCl pH 8 ແລະປະສົມກັບ 5 μM ThT (ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນສຸດທ້າຍ), ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງຕົວຢ່າງທັງຫມົດ. ປະລິມານ 50 μl.ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກຮູບພາບທຸກໆ 10 ນາທີຢູ່ທີ່ 37 ° C ໃນກ້ອງຈຸລະທັດ CellObserver (Zeiss) ທີ່ມີຊ່ອງແສງທີ່ສົ່ງຜ່ານແລະຊຸດການກັ່ນຕອງຄວາມຕື່ນເຕັ້ນແລະການປ່ອຍອາຍພິດ FITC ສໍາລັບການຖ່າຍຮູບ ThT.ເລນ 20x/0.4 ຖືກໃຊ້ສຳລັບການຖ່າຍຮູບ.Zen Blue (Zeiss) ແລະ ImageJ (https://imagej.nih.gov/) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການວິເຄາະຮູບພາບ.Gels ຍັງໄດ້ຖືກກະກຽມຈາກ NT ແລະ His-NT2RepCT solutions ໃນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ 50 mg/mL ທີ່ມີ 20 mM Tris pH 8 ແລະ 5 µM ThT ແລະ incubated ທີ່ 37 ° C ສໍາລັບ 90 ນາທີ.ຊິ້ນສ່ວນຂອງເຈນໄດ້ຖືກໂອນໄປໃສ່ນໍ້າສ້າງໃຫມ່ທີ່ບັນຈຸ 20 mM Tris, pH 8, ແລະ 5 μM ThT ໃນແຜ່ນສີດໍາທີ່ບໍ່ມີການຜູກມັດ 96 ດີ.ໄດ້ຮັບ fluorescence ສີຂຽວ ແລະຮູບພາບພາກສະຫນາມທີ່ສົດໃສຢູ່ທີ່ການຂະຫຍາຍ 20x/0.4.ImageJ ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການວິເຄາະຮູບພາບ.
ການແກ້ໄຂ NMR spectra ໄດ້ຮັບຢູ່ທີ່ 310 K ໃນ 600 MHz Bruker Avance Neo spectrometer ທີ່ຕິດຕັ້ງດ້ວຍ QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).ຕົວຢ່າງ NMR ທີ່ບັນຈຸທາດໂປຼຕີນທີ່ເປັນເອກະພາບ 10 mg/mL ທີ່ຕິດສະຫຼາກດ້ວຍ 13C, 15N, ລະລາຍໃນ 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .ການປ່ຽນແປງທາງເຄມີຂອງ NT2RepCT ທີ່ pH 6.7 ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກໍານົດຈຸດສູງສຸດ 23 ໃນ 2D spectrum ຂອງ 15N-HSQC.
Magic angle spinning solid NMR (MAS) spectra ຂອງ 13C, hydrogels ທີ່ມີປ້າຍກຳກັບ 15N ໄດ້ຖືກບັນທຶກໄວ້ໃນ Bruker Avance III HD spectrometer ທີ່ 800 MHz ພ້ອມກັບ 3.2 mm 13C/15N{1H} electronless probe.ອຸນຫະພູມຕົວຢ່າງຖືກຄວບຄຸມໂດຍໃຊ້ກະແສອາຍແກັສອຸນຫະພູມທີ່ປ່ຽນແປງໄດ້ຢູ່ທີ່ 277 K. ສອງມິຕິລະດັບ dipole rotational resonance (DARR)76 ແລະການເຊື່ອມຕໍ່ຄວາມຖີ່ວິທະຍຸ (RFDR)77 spectra ໄດ້ມາຢູ່ທີ່ຄວາມຖີ່ MAS ຂອງ 12.5 kHz ແລະ 20 kHz, ຕາມລໍາດັບ.Cross polarization (CP) ຈາກ 1H ຫາ 13C ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ເສັ້ນສາຍຈາກ 60.0 ຫາ 48.0 kHz ທີ່ 1H, 61.3/71.6 kHz ທີ່ 13C (ທີ່ 12.5/20 kHz MAS) ແລະເວລາຕິດຕໍ່ 0.5-1 ms.Spinal6478 decoupling ຢູ່ 73.5 kHz ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ໃນລະຫວ່າງການເກັບກໍາຂໍ້ມູນ.ເວລາທີ່ໄດ້ມາແມ່ນ 10 milliseconds ແລະການຊັກຊ້າຂອງວົງຈອນແມ່ນ 2.5 ວິນາທີ.ການພົວພັນ Cα/Cβ ທີ່ມີການເຊື່ອມໂຍງແບບດຽວທີ່ສັງເກດເຫັນຢູ່ໃນສະເປກຕາ RFDR ໄດ້ຖືກມອບຫມາຍໂດຍອີງໃສ່ລັກສະນະການປ່ຽນແປງທາງເຄມີປະເພດ residue ແລະຄວາມກ່ຽວຂ້ອງທີ່ເພີ່ມຂຶ້ນຫຼາຍໃນ DARR spectra.
ຖານຂໍ້ມູນ Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອປະເມີນແນວໂນ້ມກະພິບ ແລະພະລັງງານ Rosetta ສໍາລັບ NT, NTFlSp, ແລະ NTMiSp.ຖານຂໍ້ມູນ Zipper ຄິດໄລ່ Rosetta Energy80, ເຊິ່ງລວມເອົາຫຼາຍຫນ້າທີ່ພະລັງງານຟຣີເພື່ອສ້າງແບບຈໍາລອງແລະການວິເຄາະໂຄງສ້າງທາດໂປຼຕີນ.ລະດັບພະລັງງານຂອງ -23 kcal / mol ຫຼືຕ່ໍາຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງແນວໂນ້ມທີ່ຈະ fibrillate ສູງ.ພະລັງງານຕ່ໍາຫມາຍຄວາມວ່າຄວາມຫມັ້ນຄົງຫຼາຍຂອງສອງສາຍβໃນຄວາມສອດຄ່ອງຂອງ zipper.ນອກຈາກນັ້ນ, algorithm Waltz ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອຄາດຄະເນພາກພື້ນ amyloidogenic ໃນ NT, NTFlSp ແລະ NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
ການແກ້ໄຂທາດໂປຼຕີນຈາກ NT ໄດ້ຖືກປະສົມກັບ 2-(N-morpholino)ອາຊິດ ethanesulfonic (MES) buffer ທີ່ pH 5.5 ແລະ 6.0 ເພື່ອຫຼຸດລົງ pH ເປັນ pH 6 ແລະ 7, ຕາມລໍາດັບ.ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງທາດໂປຼຕີນສຸດທ້າຍແມ່ນ 100 mg / ml.
ການວັດແທກໄດ້ຖືກປະຕິບັດຢູ່ໃນ J-1500 CD spectrometer (JASCO, USA) ໂດຍໃຊ້ cuvette 300 μLທີ່ມີເສັ້ນທາງ optical 0.1 cm.ທາດໂປຼຕີນໄດ້ຖືກເຈືອຈາງເປັນ 10 μM (n = 1) ໃນ 20 mM phosphate buffer (pH 8).ເພື່ອວິເຄາະຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງທາດໂປຼຕີນໃນທີ່ປະທັບຂອງເກືອ, ທາດໂປຼຕີນໄດ້ຖືກວິເຄາະໃນຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນດຽວກັນ (n = 1) ໃນ 20 mM phosphate buffer (pH 8) ທີ່ມີ 154 mM NaF ຫຼື NaCl, ຕາມລໍາດັບ.ການສະແກນອຸນຫະພູມໄດ້ຖືກບັນທຶກຢູ່ທີ່ 222 nm ຈາກ 25 ° C ຫາ 95 ° C ດ້ວຍອັດຕາຄວາມຮ້ອນຂອງ 1 ° C / ນາທີ.ອັດຕາສ່ວນຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກເດີມໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍໃຊ້ສູດ (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).ນອກຈາກນັ້ນ, ຫ້າ spectra ໄດ້ຖືກບັນທຶກໄວ້ສໍາລັບແຕ່ລະຕົວຢ່າງຈາກ 260 nm ຫາ 190 nm ຢູ່ 25 ° C ແລະຫຼັງຈາກການໃຫ້ຄວາມຮ້ອນເຖິງ 95 ° C.ຫ້າ spectra ໄດ້ຖືກສະເລ່ຍ, smoothed ແລະປ່ຽນເປັນຮູບຮີ molar.ຂໍ້ມູນຖືກວິເຄາະໂດຍໃຊ້ Prism 9.
ຄວາມເຂັ້ມ fluorescence ຂອງ His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) ຖືກວັດແທກເປັນ triplicate (n = 3) ໃນແຜ່ນ Corning 96 ດີ ທີ່ມີດ້ານລຸ່ມໂປ່ງໃສສີດໍາ (Corning Glass 3881, USA) ພາຍໃຕ້ສະພາບຄົງທີ່.ວັດແທກຕົວຢ່າງດ້ວຍເຄື່ອງອ່ານແຜ່ນທີ່ອີງໃສ່ fluorescence ທີ່ມີຄວາມຍາວຄື້ນຄວາມຕື່ນເຕັ້ນຂອງ 395 nm ແລະບັນທຶກການປ່ອຍອາຍພິດຢູ່ທີ່ 509 nm ກ່ອນການ gelation ແລະ 2 ຊົ່ວໂມງຕໍ່ມາຢູ່ທີ່ 37 ° C.ຂໍ້ມູນຖືກວິເຄາະດ້ວຍ Prism 9.
ຊຸດທົດສອບກິດຈະກໍາຂອງ Purine nucleoside phosphorylase (ວິທີການ fluorometric, Sigma Aldrich) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ຕາມຄໍາແນະນໍາຂອງຜູ້ຜະລິດ.ເພື່ອວັດແທກການເຄື່ອນໄຫວໃນ gels ແລະວິທີແກ້ໄຂທີ່ມີ His-NT-PNP, ປະສົມ 10 ng ຂອງ His-NT-PNP ກັບ 100 mg/mL NT ກັບປະລິມານທັງຫມົດ 2 µL ເພາະວ່າເຈນໃຫ້ສັນຍານຂ້າງເທິງໄລຍະການກວດພົບຂອງຊຸດ.ການຄວບຄຸມສໍາລັບ gels ແລະການແກ້ໄຂໂດຍບໍ່ມີການ His-NT-PNP ໄດ້ຖືກລວມເຂົ້າ.ການວັດແທກໄດ້ຖືກປະຕິບັດສອງຄັ້ງ (n = 2).ຫຼັງຈາກກິດຈະກໍາໄດ້ຖືກວັດແທກ, ປະສົມຕິກິຣິຍາໄດ້ຖືກໂຍກຍ້າຍອອກແລະ gel ໄດ້ຖ່າຍຮູບເພື່ອຮັບປະກັນວ່າເຈນຍັງຄົງ intact ໃນລະຫວ່າງການວັດແທກ.ຂໍ້ມູນຖືກວິເຄາະໂດຍໃຊ້ Prism 9.
ສໍາລັບຂໍ້ມູນເພີ່ມເຕີມກ່ຽວກັບການອອກແບບການສຶກສາ, ເບິ່ງການສຶກສາທໍາມະຊາດ abstract ເຊື່ອມຕໍ່ກັບບົດຄວາມນີ້.
ຮູບທີ 1 ແລະ 2 ນຳສະເໜີຂໍ້ມູນເບື້ອງຕົ້ນ.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, ແລະ 6, ຕົວເລກເສີມ.3, ຕື່ມ fig.5a, d, ຕື່ມ fig.6 ແລະ ຕື່ມ fig.8. ຂໍ້ມູນຈາກການສຶກສານີ້ຖືກຈັດຢູ່ໃນຖານຂໍ້ມູນ Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.ຂໍ້ມູນ NMR ທີ່ໄດ້ຮັບໃນການສຶກສານີ້ໄດ້ຖືກຈັດພີມມາຢູ່ໃນບ່ອນເກັບມ້ຽນ BMRBig ພາຍໃຕ້ລະຫັດເຂົ້າ bmrbig36.ໂຄງສ້າງຂອງ GFP ແລະ PNP ໄດ້ຖືກເອົາມາຈາກ PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
ເພີ່ມຂຶ້ນ, A. ແລະ Johansson, J. Spinning ຜ້າໄຫມ spider ທຽມ.ເຄມີແຫ່ງຊາດ.ຊີວະວິທະຍາ.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.genome Nephila clavipes ຊີ້ໃຫ້ເຫັນຄວາມຫຼາກຫຼາຍຂອງພັນທຸກໍາຂອງຜ້າໄຫມ spider ແລະການສະແດງອອກທີ່ສັບສົນຂອງພວກມັນ.Genette ແຫ່ງຊາດ.49, 895–903 (2017).