ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Welded Tube ສໍາລັບອົງປະກອບທາງເຄມີຂອງອຸດສາຫະກໍາເຄມີ, ການຂາດ SPECC1L ນໍາໄປສູ່ຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງຂໍ້ຕໍ່ spliced ​​ເພີ່ມຂຶ້ນແລະການຫຼຸດລົງ shedding ຂອງຈຸລັງ neural crest cranial.

ຂໍ​ຂອບ​ໃຈ​ທ່ານ​ສໍາ​ລັບ​ການ​ຢ້ຽມ​ຢາມ Nature.com​.ທ່ານກໍາລັງໃຊ້ເວີຊັນຂອງຕົວທ່ອງເວັບທີ່ມີການສະຫນັບສະຫນູນ CSS ຈໍາກັດ.ເພື່ອປະສົບການທີ່ດີທີ່ສຸດ, ພວກເຮົາແນະນຳໃຫ້ທ່ານໃຊ້ບຣາວເຊີທີ່ອັບເດດແລ້ວ (ຫຼືປິດການນຳໃຊ້ໂໝດຄວາມເຂົ້າກັນໄດ້ໃນ Internet Explorer).ນອກຈາກນັ້ນ, ເພື່ອຮັບປະກັນການສະຫນັບສະຫນູນຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ, ພວກເຮົາສະແດງເວັບໄຊທ໌ທີ່ບໍ່ມີຮູບແບບແລະ JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Welded Tube ສໍາລັບອຸດສາຫະກໍາເຄມີ

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.ເປັນຜູ້ຜະລິດຊັ້ນນໍາທີ່ມີຄວາມຊ່ຽວຊານໃນທໍ່ສະແຕນເລດ seamless, ທໍ່ annealed ສົດໃສ, ທໍ່ coiled seamless ແລະອື່ນໆ.ເພື່ອອໍານວຍຄວາມສະດວກໃຫ້ແກ່ລູກຄ້າ, ພວກເຮົາໄດ້ມີການເຊື່ອມທໍ່ແລະທໍ່ເຊັ່ນດຽວກັນ.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.ມີອຸປະກອນການຜະລິດແລະການທົດສອບທີ່ກ້າວຫນ້າທີ່ສຸດ.ພວກ​ເຮົາ​ສາ​ມາດ​ຕອບ​ສະ​ຫນອງ​ຄວາມ​ຕ້ອງ​ການ​ຂອງ​ທ່ານ​ທັງ​ຫມົດ​.ອີງຕາມມາດຕະຖານຢ່າງເຂັ້ມງວດ, ທໍ່ທີ່ຜະລິດໂດຍພວກເຮົາສະເຫມີມີຄວາມທົນທານ OD ແລະ WT ທີ່ຖືກຕ້ອງ.ການຄວບຄຸມຄວາມທົນທານແມ່ນປະຕິບັດຕາມມາດຕະຖານການຜະລິດຢ່າງເຂັ້ມງວດ.ຜະລິດຕະພັນຂອງພວກເຮົາມີຄວາມພໍໃຈກັບລູກຄ້າສະເຫມີ.ລູກຄ້າຊື້ຜະລິດຕະພັນຂອງພວກເຮົາສ້າງກໍາໄລຫຼາຍ.
a) OD (ເສັ້ນຜ່າສູນກາງນອກ) : 3.18mm ຫາ 101.6mm
b) WT (ຄວາມຫນາຂອງຝາ): 0.5mm ຫາ 20mm
c) ຄວາມຍາວ: ອີງຕາມຄວາມຕ້ອງການຂອງລູກຄ້າ
d) ມາດຕະຖານ : ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 ແລະອື່ນໆ
e) ວິທີການຂະບວນການ: ERW, EFW ແລະອື່ນໆ

ຕົວເລື່ອນສະແດງສາມບົດຄວາມຕໍ່ສະໄລ້.ໃຊ້ປຸ່ມດ້ານຫຼັງ ແລະປຸ່ມຕໍ່ໄປເພື່ອເລື່ອນຜ່ານສະໄລ້, ຫຼືປຸ່ມຄວບຄຸມສະໄລ້ຢູ່ທ້າຍເພື່ອເລື່ອນຜ່ານແຕ່ລະສະໄລ້.
ຈຸລັງ neural crest cranial (CNCC) slough off the embryonic neural folds and migrate to the pharyngeal arches, which forms most of the midface structures.CNCC dysfunction ມີບົດບາດສໍາຄັນໃນ etiology ຂອງ cleft orofacial, ເປັນຜິດປົກກະຕິ congenital ທົ່ວໄປ.ການກາຍພັນຂອງ Heterozygous SPECC1L ໄດ້ຖືກພົບເຫັນຢູ່ໃນຄົນເຈັບທີ່ມີ clefts atypical ແລະ syndromic.ທີ່ນີ້, ພວກເຮົາລາຍງານການເພີ່ມການ staining ຂອງອົງປະກອບຂອງກາວ canonical junction (AJ), β-catenin ແລະ E-cadherin ໃນຈຸລັງ knockdown SPECC1L ວັດທະນະທໍາ, ແລະ micrographs ເອເລັກໂຕຣນິກສະແດງໃຫ້ເຫັນການແຜ່ກະຈາຍ apical-basal ຂອງ AJ.ເພື່ອເຂົ້າໃຈບົດບາດຂອງ SPECC1L ໃນ morphogenesis craniofacial, ພວກເຮົາໄດ້ສ້າງແບບຈໍາລອງຫນູທີ່ຂາດແຄນ Specc1l.Homozygous mutants ແມ່ນຕົວຕາຍຂອງ embryonic ແລະສະແດງໃຫ້ເຫັນການປິດທໍ່ neural ທີ່ມີຄວາມບົກຜ່ອງແລະການ lamination CNCC.ທາດໂປຼຕີນຈາກ AJ staining ແມ່ນເພີ່ມຂຶ້ນໃນ folds neural mutant.ຂໍ້ບົກພ່ອງ AJ ນີ້ແມ່ນສອດຄ່ອງກັບຂໍ້ບົກພ່ອງຂອງ CNCC delamination, ຮຽກຮ້ອງໃຫ້ມີການລະລາຍ AJ.ນອກຈາກນັ້ນ, Specc11 mutants ໄດ້ຫຼຸດລົງສັນຍານ PI3K-AKT ແລະເພີ່ມ apoptosis.ໃນ vitro, ການຍັບຍັ້ງການສົ່ງສັນຍານ PI3K-AKT ອ່ອນໆໃນຈຸລັງປະເພດທໍາມະຊາດແມ່ນພຽງພໍທີ່ຈະເຮັດໃຫ້ເກີດການປ່ຽນແປງ AJ.ສິ່ງສໍາຄັນ, ການປ່ຽນແປງ AJ ທີ່ຖືກກະຕຸ້ນໂດຍ SPECC1L knockdown ສາມາດຖືກຖອນຄືນໂດຍການເປີດໃຊ້ເສັ້ນທາງ PI3K-AKT.ຮ່ວມກັນ, ຂໍ້ມູນເຫຼົ່ານີ້ແນະນໍາວ່າ SPECC1L, ເປັນຕົວຄວບຄຸມນະວະນິຍາຍຂອງສັນຍານ PI3K-AKT ແລະຊີວະສາດ AJ, ແມ່ນຈໍາເປັນສໍາລັບການປິດທໍ່ neural ແລະ CNCC stratification.
ຈຸລັງ neural crest (CNCCs) ທ້ອງຖິ່ນໄປຫາ neuroectoderm dorsal ແລະແຍກອອກຈາກ neuroepithelium ຂອງ folds neural ພັດທະນາໂດຍຜ່ານຂະບວນການທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການຫັນປ່ຽນ epithelial-mesenchymal (EMT)1,2,3.Premigrating epithelial CNCCs disrupt intercellular junctions ແລະກາຍເປັນການເຄື່ອນຍ້າຍ CNCCs mesenchymal ທີ່ຕື່ມຂໍ້ມູນໃສ່ arches pharyngeal ທໍາອິດແລະທີສອງແລະປະກອບເປັນ cartilage craniofacial ສ່ວນໃຫຍ່.ດັ່ງນັ້ນ, ພັນທຸ ກຳ ທີ່ຄວບຄຸມການເຮັດວຽກຂອງ CNCC ມັກຈະຖືກລົບກວນໃນ etiology ຂອງຜິດປົກກະຕິ congenital craniofacial ເຊັ່ນ orofacial clefts, ສ່ວນຫຼາຍແມ່ນຜົນກະທົບຕໍ່ການເກີດລູກ 1/800 ໃນສະຫະລັດຢ່າງດຽວ.ຫນຶ່ງໃນຜິດປົກກະຕິແຕ່ກໍາເນີດ8.
Delamination ຂອງ CNCC ກົງກັນກັບການປິດທໍ່ neural ທາງຫນ້າລະຫວ່າງ 8.5 ແລະ 9.5 ມື້ຂອງການພັດທະນາ embryonic ໃນຫນູ.mutants ຂອງພັນທຸກໍາທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ cleft orofacial ຂອງຫນູຍັງສະແດງໃຫ້ເຫັນບາງຮູບແບບຂອງຄວາມຜິດປົກກະຕິຂອງທໍ່ neural, ລວມທັງ Irf69,10, Ghrl310, Cfl111, ແລະ Pdgfrα12.ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ຂະບວນການປິດທໍ່ neural ແລະ stratification CNCC ສາມາດພິຈາລະນາເປັນເອກະລາດ, ຍ້ອນວ່າ Splotch mutant mouse (Pax3) ສະແດງໃຫ້ເຫັນຂໍ້ບົກພ່ອງໃນການປິດທໍ່ neural ໂດຍບໍ່ມີຜົນກະທົບໃດໆຕໍ່ການ stratification CNCC ຫຼືການເຄື່ອນຍ້າຍ 13,14.ແບບຈໍາລອງຫນູເພີ່ມເຕີມທີ່ມີຂໍ້ບົກພ່ອງຂອງ CNCC dissection ແລະການປິດທໍ່ neural ຈະຊ່ວຍ delineate ພື້ນຖານໂມເລກຸນທົ່ວໄປຂອງທັງສອງຂະບວນການນີ້.
ການໂດດດ່ຽວຂອງ CNCC ຈາກຈຸລັງ neuroepithelial ຮຽກຮ້ອງໃຫ້ມີການລະລາຍຂອງຈຸດເຊື່ອມຕໍ່ຂອງກາວ (AJs), ເຊິ່ງປະກອບດ້ວຍທາດໂປຼຕີນທີ່ມີສະລັບສັບຊ້ອນ, ໃນບັນດາອື່ນໆ, E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin, ແລະ α-actinin ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ filaments actin 2. ການສຶກສາ overexpression E-cadherin ໃນ folds neural ສະແດງໃຫ້ເຫັນການຫຼຸດຜ່ອນຫຼືຊັກຊ້າໃນ CNCC delamination.ໃນທາງກັບກັນ, ການສະກັດກັ້ນ E-cadherin ເຮັດໃຫ້ເກີດການແບ່ງຂັ້ນຕົ້ນ 15,16.ຫຼາຍໆປັດໃຈທີ່ໄກ່ເກ່ຍ EMT ໃນລະຫວ່າງການຈັດແບ່ງຂັ້ນ CNCC ແມ່ນປັດໃຈການຖ່າຍທອດ (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) ແລະໂປຣຕີນທີ່ປ່ຽນຮູບແບບ extracellular matrix (ECM) ເຊັ່ນ matrix metalloproteinases (MMPs), ຢ່າງໃດກໍຕາມ CNCCs ແມ່ນ cytoskeletal ໂດຍກົງ AJ. ຍັງບໍ່ທັນຮູ້ເທື່ອ.ເສັ້ນທາງ PI3K-AKT ເປັນທີ່ຮູ້ຈັກທີ່ຈະຕ້ານກັບລະດັບ E-cadherin, ສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນມາຈາກການຄົ້ນຄວ້າມະເຮັງ17.ການສຶກສາທີ່ຜ່ານມາໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການສູນເສຍສັນຍານ PI3K-AKT ທີ່ອີງໃສ່ PDGFα ໃນຫນູເຮັດໃຫ້ຄວາມຜິດປົກກະຕິ craniofacial, ລວມທັງ palate cleft ແລະຜິດປົກກະຕິທໍ່ neural12.ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ຄວາມສໍາພັນລະຫວ່າງເສັ້ນທາງ PI3K-AKT ແລະຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງ AJ ຕາມການແບ່ງຊັ້ນ CNCC ແມ່ນບໍ່ຈະແຈ້ງ.
ກ່ອນຫນ້ານີ້ພວກເຮົາໄດ້ກໍານົດ SPECC1L ເປັນ gene mutant ທໍາອິດໃນສອງຄົນທີ່ມີ cleft ຮ້າຍແຮງທີ່ຂະຫຍາຍອອກຈາກປາກໄປຫາຕາ, ເອີ້ນວ່າ oblique cleft (ObFC) ຫຼື Tessier IV18 cleft.ການກາຍພັນຂອງ SPECC1L ໄດ້ຖືກພົບເຫັນຢູ່ໃນສອງຄອບຄົວຫຼາຍຮຸ່ນທີ່ມີໂຣກ autosomal dominant Opitz G/BBB (OMIM #145410), ເຊິ່ງຜູ້ທີ່ໄດ້ຮັບຜົນກະທົບໄດ້ສະແດງ hyperdistance ແລະປາກແຕກ / palate19, ແລະໃນຄອບຄົວດຽວທີ່ມີໂຣກ Tibi overdistance (OMIM #145420)20. .ຫຼາຍກວ່າເຄິ່ງຫນຶ່ງຂອງກໍລະນີຂອງໂຣກ Opitz G/BBB ແມ່ນເປັນໂຣກ X-linked (OMIM #300000) ແລະເກີດມາຈາກການກາຍພັນໃນ gene MID1, ເຊິ່ງເຂົ້າລະຫັດໂປຣຕີນ 22 ຂອງໂຄງກະດູກຈຸລັງທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ microtubule.ພວກເຮົາສົມມຸດຕິຖານວ່າ SPECC1L, ຍັງເປັນທາດໂປຼຕີນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ microtubules ແລະ cytoskeleton actin, ອາດຈະໄກ່ເກ່ຍສັນຍານທີ່ຈໍາເປັນສໍາລັບການປັບຕົວຂອງ actin cytoskeleton ໃນລະຫວ່າງການຍຶດຕິດຂອງເຊນແລະການເຄື່ອນຍ້າຍ 18 .ໂດຍຜ່ານການສຶກສາໃນ vitro ແລະໃນ vivo, ໃນປັດຈຸບັນພວກເຮົາອະທິບາຍ SPECC1L ເປັນຜູ້ຄວບຄຸມນະວະນິຍາຍຂອງຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງ AJ ໂດຍຜ່ານສັນຍານ PI3K-AKT.ໃນລະດັບຈຸລັງ, ການຂາດ SPECC1L ເຮັດໃຫ້ເກີດການຫຼຸດລົງໃນລະດັບຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ pan-AKT ແລະການເພີ່ມຂື້ນຂອງການກະແຈກກະຈາຍຂອງ apical-basal ຂອງ AJ, ເຊິ່ງຖືກລົບລ້າງໂດຍການກະຕຸ້ນທາງເຄມີຂອງເສັ້ນທາງ AKT.ໃນ vivo, embryos ຂາດ Specc11 ສະແດງໃຫ້ເຫັນການປິດທໍ່ neural ທີ່ມີຄວາມບົກຜ່ອງແລະການຫຼຸດຜ່ອນການຕັດ CNCC.ດັ່ງນັ້ນ, SPECC1L ປະຕິບັດຫນ້າທີ່ຢູ່ໃນສັນຍານການຍຶດຫມັ້ນຂອງເຊນທີ່ມີການຄວບຄຸມສູງທີ່ຕ້ອງການສໍາລັບການທໍາງານ CNCC ປົກກະຕິໃນລະຫວ່າງການ morphogenesis facial.
ເພື່ອກໍານົດລັກສະນະບົດບາດຂອງ SPECC1L ໃນລະດັບເຊວລູລາ, ພວກເຮົາໄດ້ນໍາໃຊ້ເສັ້ນຈຸລັງ osteosarcoma ຄົງທີ່ທີ່ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນຫນ້ານີ້ U2OS ຂາດຢູ່ໃນ SPECC1L18.ຈຸລັງ U2OS ທີ່ຄົງທີ່ເຫຼົ່ານີ້ທີ່ມີ SPECC1L (kd) knockdown ມີການຫຼຸດລົງໃນລະດັບປານກາງ (60–70%) ໃນລະດັບຂອງ SPECC1L transcripts ແລະທາດໂປຼຕີນ, ພ້ອມກັບຂໍ້ບົກພ່ອງໃນການເຄື່ອນຍ້າຍແລະການຈັດລະບຽບໃຫມ່ຂອງ actin cytoskeleton 18. ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ການຫຼຸດລົງຊົ່ວຄາວຮ້າຍແຮງໃນ SPECC1L ໄດ້ຖືກສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່ານໍາໄປສູ່ຄວາມຜິດປົກກະຕິ mitotic 23 .ເມື່ອມີລັກສະນະເພີ່ມເຕີມ, ພວກເຮົາພົບເຫັນວ່າຈຸລັງ SPECC1L-kd ຂອງພວກເຮົາທີ່ຫມັ້ນຄົງມີການປ່ຽນແປງ morphology ໃນລະດັບສູງຂອງ confluence (ຮູບ 1).ເຊັລຄວບຄຸມສ່ວນບຸກຄົນ ແລະເຊລ kd ຢູ່ທີ່ຈຸດເຊື່ອມຕໍ່າເບິ່ງຄ້າຍຄືກັນ (ຮູບ 1A,D).24 ຊົ່ວໂມງຫຼັງຈາກ fusion, ຈຸລັງຄວບຄຸມໄດ້ຮັກສາຮູບຮ່າງ cuboidal ຂອງເຂົາເຈົ້າ (ຮູບ 1B, E), ໃນຂະນະທີ່ຈຸລັງ SPECC1L-kd elongated (ຮູບ 1C, F).ຂອບເຂດຂອງການປ່ຽນແປງໃນຮູບຮ່າງເຊລນີ້ໄດ້ຖືກບັນທຶກໂດຍການຖ່າຍຮູບສົດໃນ vivo ຂອງເຊລຄວບຄຸມ ແລະເຊລ kd (ຮູບເງົາ 1).ເພື່ອກໍານົດບົດບາດຂອງ SPECC1L ໃນຈຸລັງທີ່ປະສົມປະສານ, ພວກເຮົາທໍາອິດກວດເບິ່ງການສະແດງອອກຂອງມັນ.ພວກເຮົາພົບວ່າລະດັບທາດໂປຼຕີນຈາກ SPECC1L ເພີ່ມຂຶ້ນຕາມການປະສົມ (ຮູບ 1G), ໃນຂະນະທີ່ລະດັບການຖອດຂໍ້ຄວາມ SPECC1L ບໍ່ໄດ້ເພີ່ມຂຶ້ນ (ຮູບ 1H).ນອກຈາກນັ້ນ, ເມື່ອຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງເຊນເພີ່ມຂຶ້ນ, ທາດໂປຼຕີນຈາກ SPECC1L ທີ່ສະສົມຢູ່ເຂດແດນລະຫວ່າງຈຸລັງ (ຮູບ 2A-E), ທີ່ມີຮູບແບບການທັບຊ້ອນກັນກັບເຍື່ອຫຸ້ມເຊນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບβ-catenin (ຮູບ 2A'-E').ເນື່ອງຈາກການເຊື່ອມໂຍງຂອງ SPECC1L ກັບ actin cytoskeleton 18,23 ພວກເຮົາສົມມຸດຕິຖານວ່າ SPECC1L ມີປະຕິກິລິຍາກັບຈຸດເຊື່ອມຕໍ່ຂອງກາວທີ່ອີງໃສ່ actin (AJ).
(AF) SPECC1L knockdown (DF) ເຊ​ລ elongation at high confluence (F) ເມື່ອ​ທຽບ​ໃສ່​ກັບ​ເຊ​ລ U2OS ຄວບ​ຄຸມ (AC).ສະແດງໃຫ້ເຫັນນີ້ແມ່ນສາມໃນຫົກຈຸດເວລາ (T1, T3, T6) ທີ່ພວກເຮົາເລືອກສໍາລັບຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງເຊນທີ່ແຕກຕ່າງກັນ.(G) ການວິເຄາະ blot ຕາເວັນຕົກສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າທາດໂປຼຕີນຈາກ SPECC1L ແມ່ນສະຖຽນລະພາບໃນລະດັບສູງຂອງ confluence ເມື່ອທຽບກັບລະດັບຕ່ໍາຂອງ confluence ໃນຈຸລັງຄວບຄຸມ.blot ຕາເວັນຕົກຂອງ SPECC1L ສະແດງໃຫ້ເຫັນແຖບ 120 kDa ທີ່ຄາດໄວ້ແລະແຖບນ້ໍາຫນັກໂມເລກຸນທີ່ສູງກວ່າ, ອາດຈະເປັນການດັດແກ້ຫລັງການແປ (*).ການວິເຄາະ blot ຂອງຕາເວັນຕົກໄດ້ຖືກປະຕິບັດພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂດຽວກັນສໍາລັບການ confluence ຕ່ໍາແລະສູງ.ຮູບພາບທີ່ສະແດງ SPECC1L ຢູ່ຈຸດທີ່ຕໍ່າ ແລະສູງແມ່ນຖ່າຍຈາກຈຸດດຽວກັນ.blot ດຽວກັນໄດ້ຖືກໂຍກຍ້າຍອອກແລະກວດກາຄືນໃຫມ່ດ້ວຍ β-actin antibody.(H) ການວິເຄາະ RT-PCR ປະລິມານບໍ່ສະແດງໃຫ້ເຫັນການປ່ຽນແປງທີ່ສໍາຄັນໃນລະດັບ SPECC1L transcript.ແຖບຄວາມຜິດພາດເປັນຕົວແທນ SEMs ຈາກສີ່ການທົດລອງເອກະລາດ.
(AE) ພວກເຮົາເລືອກຈຸດເວລາຫົກ (T1-T6) ທີ່ເປັນຕົວແທນຂອງລະດັບຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງເຊນເພື່ອປັບການວິເຄາະຮູບຮ່າງຂອງເຊນເປັນປົກກະຕິແລະການປ່ຽນແປງ AJ ໃນຈຸລັງ U2OS ດ້ວຍ SPECC1L knockdown (kd).ຫ້າຈຸດເວລາທໍາອິດເຫຼົ່ານີ້ລວມມີເຊລດຽວ (T1), 50-70% fusion ຂອງກຸ່ມຈຸລັງຂະຫນາດນ້ອຍ (T2), fusion ໂດຍບໍ່ມີການ reshaping ຈຸລັງ kd (T3), reshaping cells kd (T4), ແລະການປ່ຽນແປງ 24 ຊົ່ວໂມງ.ໃນຮູບແບບຫຼັງຂອງເຊລ kd (T5).ທາດໂປຼຕີນຈາກ SPECC1L ໄດ້ຖືກກະແຈກກະຈາຍສ່ວນໃຫຍ່ໃນ cytoplasm ຢູ່ T1 (A), ແຕ່ການສະສົມຂອງມັນຖືກສັງເກດເຫັນຢູ່ໃນຂອບເຂດລະຫວ່າງຈຸລັງໃນຈຸດເວລາຕໍ່ມາ (B-E, ລູກສອນ).(FJ) β-catenin ສະແດງໃຫ້ເຫັນການສະສົມທີ່ຄ້າຍຄືກັນຢູ່ໃນຂອບເຂດ intercellular ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບສະລັບສັບຊ້ອນ AJ.(A'-E') SPECC1L ແລະ β-catenin ສະແດງໃຫ້ເຫັນການທັບຊ້ອນກັນຢູ່ຂອບເຊລທີ່ຄວາມໜາແໜ້ນຂອງເຊລສູງ (ລູກສອນ).(F'-J') ໃນຈຸລັງ SPECC1L-kd, ການຍັບຍັ້ງ β-catenin ປະກົດວ່າປົກກະຕິຢູ່ທີ່ຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງເຊນຕໍ່າ (F'-H'), ແຕ່ຂະຫຍາຍອອກໄປເມື່ອມີການປ່ຽນແປງຮູບຮ່າງຂອງເຊນ (I', J'; ລູກສອນ), ຊີ້ບອກວ່າ AJ ມີການປ່ຽນແປງ.ບາ = 10 µm.
ຫຼັງຈາກນັ້ນພວກເຮົາໄດ້ພະຍາຍາມກໍານົດຜົນກະທົບຂອງການຂາດ SPECC1L ໃນ AJ.ພວກເຮົາໄດ້ນໍາໃຊ້ເຄື່ອງຫມາຍທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ AJ ຈໍານວນຫນຶ່ງ, ລວມທັງອົງປະກອບ canonical F-actin, myosin IIb, β-catenin, ແລະ E-cadherin24,25,26,27.ເສັ້ນໃຍຄວາມກົດດັນ Actin ເພີ່ມຂຶ້ນໃນເຊລ SPECC1L-kd ຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນໜ້ານີ້ (ຮູບ 3A,B) 18 .Myosin IIb ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ filaments actin ສະແດງໃຫ້ເຫັນການເພີ່ມຂື້ນທີ່ຄ້າຍຄືກັນໃນຈຸລັງ SPECC1L-kd ໃນ vitro (ຮູບ 3C,D).AJ-associated β-catenin ຜູກມັດກັບ cadherin ຢູ່ເຍື່ອເຊນ, ສະແດງໃຫ້ເຫັນຮູບແບບການສະແດງອອກ "honeycomb" ປົກກະຕິໃນ cubocytes ຄວບຄຸມ (ຮູບ 3E, G).ຫນ້າສົນໃຈ, ໃນຮູບພາບຮາບພຽງໂດຍນໍາໃຊ້ກ້ອງຈຸລະທັດ confocal, β-catenin (ຮູບ 3E, F) ແລະ E-cadherin (ຮູບ 3G, H) staining ເທິງເຍື່ອຂອງຈຸລັງ confluent SPECC1L-staining ສະແດງໃຫ້ເຫັນຮູບແບບທີ່ໂດດເດັ່ນຂອງການ staining ຂະຫຍາຍ.ການຂະຫຍາຍຕົວຂອງ AJ-ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການ staining β-catenin ໃນຈຸລັງ kd ໄດ້ຖືກປະກາດຫຼາຍທີ່ສຸດຢູ່ທີ່ confluence, ແຕ່ປະກົດວ່າການປ່ຽນແປງໃນຮູບຮ່າງຂອງຈຸລັງກ່ອນຫນ້າ (ຮູບ 2F-J, F'-J').ເພື່ອກໍານົດລັກສະນະທາງກາຍະພາບຂອງການ staining AJ ຂະຫຍາຍນີ້, ພວກເຮົາໄດ້ກວດເບິ່ງຊາຍແດນຂອງເຊນຢູ່ດ້ານເທິງຂອງ apical-basal ຂອງຈຸລັງ SPECC1L-kd U2OS ໂດຍການສົ່ງຜ່ານກ້ອງຈຸລະທັດເອເລັກໂຕຣນິກ (TEM) (ຮູບ 3I,J).ໃນທາງກົງກັນຂ້າມກັບຈຸລັງຄວບຄຸມ (ຮູບ 3I), ທີ່ມີພື້ນທີ່ຫນາແຫນ້ນຂອງເອເລັກໂຕຣນິກທີ່ແຍກຕ່າງຫາກຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງ AJ (ລູກສອນ), ຈຸລັງ kd (ຮູບ 3J) ສະແດງໃຫ້ເຫັນຂະຫນາດໃຫຍ່, ພາກພື້ນຕິດຕໍ່ກັນຂອງຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງເອເລັກໂຕຣນິກສູງ AJ ຕາມຍົນ apicobasal..ນອກຈາກນັ້ນ, ໃນພາກສ່ວນທາງຂວາງ, ພວກເຮົາໄດ້ສັງເກດເຫັນການພັບຂອງເຍື່ອຫຸ້ມເຊນຢ່າງກວ້າງຂວາງໃນຈຸລັງ kd (ຮູບ S1A, B), ເຊິ່ງອະທິບາຍເຖິງຮູບແບບການຂະຫຍາຍຂອງແຖບ β-catenin ແລະ E-cadherin (ຮູບ 3F, H).ໃນການສະຫນັບສະຫນູນບົດບາດຂອງ SPECC1L ໃນ AJs, β-catenin ໄດ້ຖືກຮ່ວມ immunoprecipitated ກັບ SPECC1L ໃນ lysates ຂອງຈຸລັງ U2OS confluent (ຮູບ 3K).ຄຽງຄູ່ກັບການຂະຫຍາຍພູມຕ້ານທານສໍາລັບເຄື່ອງຫມາຍ AJ, ການວິເຄາະ TEM ແມ່ນສອດຄ່ອງກັບສົມມຸດຕິຖານຂອງພວກເຮົາວ່າການຂາດ SPECC1L ເພີ່ມຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງ AJ apical-basal ແລະຄວາມແຕກຕ່າງກັນ.
(AH) ເພີ່ມການຍັບຍັ້ງ F-actin ໃນຈຸລັງ kd ໃນເວລາ 48 ຊົ່ວໂມງຫຼັງການປະສົມ (T6; A, B).ການປ່ຽນແປງການຍ້ອມສີຂອງ myosin IIb ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ F-actin (C, D).ຮູບແບບກ້ຽງຂອງເບຕ້າແຄທີນິນແລະ E-cadherin staining ເຍື່ອໃນຈຸລັງຄວບຄຸມ (E, G) ໄດ້ຖືກປັບປຸງໃນຈຸລັງ SPECC1L-kd (F, H).ບາ = 10 µm.(I–J) ກ້ອງຈຸລະທັດອີເລັກໂທຣນິກທີ່ສັງເກດເຖິງຈຸດເຊື່ອມຕໍ່ລະຫວ່າງຈຸລັງ apical-basal.ເຊລຄວບຄຸມສະແດງພື້ນທີ່ທີ່ມີຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງອິເລັກໂທຣນິກທີ່ແຕກຕ່າງທີ່ຊີ້ບອກຈຸດຕິດຂັດ (I, ລູກສອນ).ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ຈຸດເຊື່ອມຕໍ່ apical-basal ທັງຫມົດໃນຈຸລັງ SPECC1L-kd ປະກົດວ່າມີຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງເອເລັກໂຕຣນິກ (J, ລູກສອນ), ເຊິ່ງຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງຄວາມຫນາແຫນ້ນແລະການກະແຈກກະຈາຍຂອງຈຸດເຊື່ອມຕໍ່ຂອງກາວ.(K) β-catenin ໄດ້ຖືກຮ່ວມ immunoprecipitated ກັບ SPECC1L ໃນ lysates ເຊນ U2OS confluent.ຮູບພາບທີ່ຖ່າຍຈາກຈຸດຫນຶ່ງທີ່ເປັນຕົວແທນຫນຶ່ງໃນສີ່ການທົດລອງເອກະລາດ.
ເພື່ອເຂົ້າໃຈບົດບາດຂອງ SPECC1L ໃນ craniofacial morphogenesis, ພວກເຮົາໄດ້ສ້າງແບບຈໍາລອງຫນູທີ່ຂາດແຄນ Specc1l ໂດຍໃຊ້ສອງເສັ້ນເຊລດັກ ES ເອກະລາດ, DTM096 ແລະ RRH048 (BayGenomics, CA), ເຊິ່ງເປັນຕົວແທນຂອງ intron 1 ແລະ Specc1l transcripts ໄດ້ຖືກຈັບຢູ່ທີ່ 15 (ຮູບ 1) .4A, ຮູບ S2).ສະຖານທີ່ genomic ຂອງ decoy vector insert ໄດ້ຖືກກໍານົດໂດຍລໍາດັບ genome ທັງຫມົດແລະຢືນຢັນໂດຍ PCR (ຮູບ S2).ການອອກແບບຈັ່ນຈັບ gene ທັງສອງຍັງອະນຸຍາດໃຫ້ປະສົມປະສານໃນກອບຂອງນັກຂ່າວ Specc11-lacZ ເມື່ອຖືກຈັບ.ດັ່ງນັ້ນ, ການສະແດງອອກຂອງ lacZ ທີ່ກໍານົດໂດຍ X-gal staining ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນຕົວຊີ້ວັດຂອງການສະແດງ Specc11.ທັງສອງ alleles ສະແດງໃຫ້ເຫັນຮູບແບບການສະແດງອອກຂອງ lacZ ທີ່ຄ້າຍຄືກັນ, ດ້ວຍ DTM096 gene trap ໃນ intron 1 ສະແດງໃຫ້ເຫັນການສະແດງອອກທີ່ເຂັ້ມແຂງກວ່າ RRH048 ໃນ intron 15 (ບໍ່ສະແດງ).ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, Specc1l ສະແດງອອກຢ່າງກວ້າງຂວາງ, ດ້ວຍການສະແດງອອກທີ່ເຂັ້ມແຂງໂດຍສະເພາະໃນ folds neural ຢູ່ E8.5 (ຮູບ 4B), ໃນທໍ່ neural ແລະຂະບວນການ facial ທີ່ E9.5 ແລະ E10.5 (ຮູບ 4C, D), ແລະໃນການພັດທະນາຂອງແຂນຂາ. ທີ່ E10.5 ແລະຕາ (ຮູບ 4D).ກ່ອນຫນ້ານີ້ພວກເຮົາໄດ້ລາຍງານວ່າການສະແດງອອກຂອງ SPECC1L ໃນທ້ອງຟ້າ pharyngeal ທໍາອິດຢູ່ທີ່ E10.5 ແມ່ນມີຢູ່ໃນ epithelium ແລະ mesenchyme18 ທີ່ຕິດພັນ, ສອດຄ່ອງກັບສາຍພັນ CNCC.ເພື່ອທົດສອບການສະແດງອອກຂອງ SPECC1L ໃນ CNCC, ພວກເຮົາໄດ້ປະຕິບັດ E8.5 neural folds (ຮູບ 4E-J) ແລະ E9.5 skull sections (ຮູບ 4K-).ຢູ່ທີ່ E8.5, SPECC1L ເຮັດໃຫ້ມີຮອຍເປື້ອນຂອງເສັ້ນປະສາດຢ່າງເຂັ້ມຂຸ້ນ (ຮູບ 4E, H), ລວມທັງເຊນທີ່ມີເຄື່ອງໝາຍ NCC (ຮູບ 4G, J).ຢູ່ທີ່ E9.5, SPECC1L (ຮູບ 4K, N) stained ຢ່າງແຂງແຮງການເຄື່ອນຍ້າຍ CNCC ຮ່ວມກັບ AP2A (ຮູບ 4L, M) ຫຼື SOX10 (ຮູບ 4O, P).
(A) ການສະແດງແບບແຜນຂອງ gene Specc11 ຂອງຫນູທີ່ສະແດງການແຊກ vector decoy ໃນ ES DTM096 (intron 1) ແລະ RRH048 (intron 15) cell clones.(BD) lacZ staining ຂອງ heterozygous Specc1lDTM096 embryos ເປັນຕົວແທນຂອງການສະແດງ Specc1l ຈາກ E8.5 ຫາ E10.5.NE = neuroectoderm, NF = neural fold, PA1 = ທ້ອງຟ້າ pharyngeal ທໍາອິດ.(EP) SPECC1L immunostaining ກັບ NCC markers AP2A ແລະ SOX10 ໃນ E8.5 (NF; EJ) neural folds ແລະ E9.5 (KP) skull sections.ການຍ້ອມສີ SPECC1L ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນຢ່າງກວ້າງຂວາງໃນແຜ່ນພັບ neural E8.5 (E, H; ຫົວລູກສອນ), ລວມທັງຈຸລັງທີ່ມີປ້າຍຊື່ AP2A (F, G; ຫົວລູກສອນ) ແລະ SOX10 (I, J; ຫົວລູກສອນ).ຢູ່ທີ່ E9.5, SPECC1L stained ຢ່າງແຂງແຮງ CNCCs ການເຄື່ອນຍ້າຍ (K, N; ລູກສອນ) ທີ່ມີປ້າຍຊື່ AP2A (L, M; ລູກສອນ) ແລະ SOX10 (O, P; ລູກສອນ).
ຂ້າມລະຫວ່າງຮອກແລະຫນູ Specc1lDTM096/+ heterozygous ແລະ Specc1lRRH048/+ ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າສອງ gene trap alleles ແມ່ນບໍ່ສົມກັນແລະວ່າ heterozygotes ປະສົມແລະ homozygotes embryonic ສໍາລັບທັງສອງ gene trap allele ແມ່ນຕົວຕາຍຂອງຕົວອ່ອນ (ຕາຕະລາງ S1).ອັດຕາສ່ວນ Mendelian ຊີ້ໃຫ້ເຫັນການຫຼຸດລົງຂອງອັດຕາການຢູ່ລອດຂອງ heterozygotes ໃນເວລາເກີດ (ຄາດຫມາຍວ່າ 1.34 ທຽບກັບ 2.0).ພວກເຮົາສັງເກດເຫັນອັດຕາການຕາຍຂອງ perinatal ຕ່ໍາໃນບັນດາ heterozygotes, ບາງຄົນມີຄວາມຜິດປົກກະຕິ craniofacial (ຮູບ S3).ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ຕ່ໍາ penetrance ຂອງ phenotypes craniofacial perinatal ເຫຼົ່ານີ້ເຮັດໃຫ້ມັນມີຄວາມຫຍຸ້ງຍາກໃນການສຶກສາກົນໄກການ pathophysiological ພື້ນຖານຂອງເຂົາເຈົ້າ.ດັ່ງນັ້ນ, ພວກເຮົາໄດ້ສຸມໃສ່ phenotype lethal embryonic ຂອງ homozygous Specc11 mutants.
ທາດປະສົມສ່ວນໃຫຍ່ heterozygous ຫຼື homozygous Specc1lDTM096/RRH048 embryos mutant ບໍ່ໄດ້ພັດທະນາຫຼັງຈາກ E9.5–10.5 (ຮູບ 5A–D), ແລະທໍ່ neural ບໍ່ໄດ້ປິດດ້ານຫນ້າ (ຮູບ 5B, D) ແລະບາງຄັ້ງກໍ່ປິດທາງຫລັງ (ບໍ່ສະແດງ) ..ຂໍ້ບົກພ່ອງຂອງການປິດທໍ່ neural cranial ນີ້ແມ່ນກ່ຽວຂ້ອງກັບສ່ວນໃຫຍ່ຂອງ CNCC ທີ່ຫມາຍ DLX2 ທີ່ຍັງເຫຼືອຢູ່ໃນ folds neural ຢູ່ E10.5, ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າບໍ່ມີການແຍກ (ຮູບ 5A'-D').ເພື່ອກໍານົດວ່າຂະຫນາດລວມຂອງ CNCC ໄດ້ຖືກຫຼຸດລົງເຊັ່ນດຽວກັນ, ພວກເຮົາໄດ້ຕິດແທໍກສາຍ CNCC ກັບ GFP ໃນເສັ້ນດັກ gene ຂອງພວກເຮົາກັບ Wnt1-Cre ແລະ ROSAmTmG.ພວກເຮົາຈັດຮຽງ GFP+ NCC ແລະ GFP- (RFP+) ທີ່ບໍ່ແມ່ນ NCC ຈາກ embryos ທັງຫມົດ.ຢູ່ທີ່ E9.5, ອັດຕາສ່ວນຂອງ CNCCs GFP ທີ່ຕິດສະຫຼາກການໄຫຼເຂົ້າບໍ່ໄດ້ມີການປ່ຽນແປງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍລະຫວ່າງ WT ແລະ embryos mutant (ບໍ່ສະແດງໃຫ້ເຫັນ), ເຊິ່ງຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງຂໍ້ກໍານົດຂອງ CNCC ປົກກະຕິ.ດັ່ງນັ້ນ, ພວກເຮົາສົມມຸດວ່າການຕົກຄ້າງຂອງ Wnt1-Cre ແລະ DLX2 ໃນ folds neural exposed (ຮູບ 5B') ແມ່ນເນື່ອງມາຈາກການວາງ CNCC ຜິດປົກກະຕິ, ອາດຈະເປັນຍ້ອນຄວາມຫນາແຫນ້ນເພີ່ມຂຶ້ນຫຼືການກະຈາຍຂອງຈຸລັງ AJ, ດັ່ງທີ່ເຫັນຢູ່ໃນຈຸລັງ SPECC1L-kd.ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ເຄື່ອງໝາຍ NCC SOX10, AP2A, ແລະ DLX2 ເພື່ອຢືນຢັນການປະກົດຕົວຂອງ CNCC ຢູ່ໃນເສັ້ນປະສາດ (ຮູບ 5E-R).ຢູ່ທີ່ E8.5, ຮອຍເປື້ອນ neural fold ສໍາລັບທັງສາມເຄື່ອງຫມາຍ NCC ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນຢູ່ໃນພາກສ່ວນຂອງ WT (ຮູບ 5E, G, I) ແລະ Specc1l mutant (ຮູບ 5F, H, J).ຢູ່ທີ່ E9.5, ໃນຂະນະທີ່ເຄື່ອງຫມາຍ NCC stained ການເຄື່ອນຍ້າຍ NCC ໃນພາກສ່ວນ WT (ຮູບ 5M, O, Q), ຮອຍເປື້ອນ NCC ທີ່ເຫຼືອໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນຢູ່ໃນພັບ neural ທີ່ເປີດເຜີຍຂອງ Specc1l mutant embryos (ຮູບ 5N, P, R).ເນື່ອງຈາກວ່າ SOX10 ແລະ DLX2 ໝາຍເຖິງການເຄື່ອນຍ້າຍ CNCCs, ຜົນໄດ້ຮັບນີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ CNCCs ຂາດ SPECC1L ບັນລຸຂໍ້ມູນສະເພາະຫຼັງການຍ້າຍຖິ່ນຖານແຕ່ບໍ່ສາມາດເຄື່ອນຍ້າຍອອກຈາກເສັ້ນປະສາດ.
ການຂາດ Specc11 ນໍາໄປສູ່ການປິດທໍ່ neural ຜິດປົກກະຕິ, delamination ຂອງຈຸລັງ neural crest cranial ແລະ AJs.
(A, B') E9.5 WT (A) Embryo ແບກຫາບຈຸລັງປະສາດ cranial cranial (CNCC) ທີ່ມີປ້າຍກຳກັບ Wnt1-Cre (A').ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, Specc11 mutant embryos ສະແດງໃຫ້ເຫັນ folds neural ເປີດ (B), ຫົວລູກສອນ) ແລະ CNCCs ທີ່ບໍ່ໄດ້ເຄື່ອນຍ້າຍ (B', ຫົວລູກສອນ).(C, D') ຮູບພາບພາກສະຫນາມສົດໃສ (C, D') ແລະ immunostaining (C', D') ຂອງ CNCC marker DLX2 ຂອງ E10.5 WT embryos (C, C') ແລະ Specc1l (D, D').ໃນ embryos WT E10.5, DLX2-positive CNCC colonize the gill arches (C', arrows), ໃນຂະນະທີ່ຢູ່ໃນ mutants, staining conspicuous ຍັງຄົງຢູ່ໃນ folds neural ເປີດ (D', ລູກສອນ) ແລະໃນ arches pharyngeal ທໍາອິດ (D', ລູກສອນ).) ມີຮອຍດ່າງບາງ (ລູກສອນ) ຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງ delamination ທີ່ບໍ່ດີແລະການເຄື່ອນຍ້າຍຂອງ CNCC.ER) ພາກສ່ວນຂອງ WT ແລະ Specc1l mutant embryos ໃນຂັ້ນຕອນ E8.5 (E–L) ແລະ E9.5 (M–R) ຖືກຕິດສະຫຼາກດ້ວຍເຄື່ອງໝາຍ NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) ແລະ DLX2 (I, J, Q, R).ຢູ່ທີ່ E8.5, NCC staining ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນຢູ່ໃນ fold neural ປະເພດປ່າທໍາມະຊາດ (NF) ແລະພາກສ່ວນ mutant.ການຍັບຍັ້ງການຮ່ວມຂອງ SOX10 ແລະ β-catenin ໃນ E8.5 WT (K) ແລະ mutant (L) ເປີດເຜີຍການເພີ່ມການ staining β-catenin ຢູ່ເຂດແດນຂອງຈຸລັງໃນ folds neural.ຢູ່ທີ່ E9.5, ຮອຍເປື້ອນປະເພດທໍາມະຊາດຂອງ CNCCs ເຄື່ອນຍ້າຍ (M, O, Q) ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນ, ໃນຂະນະທີ່ຢູ່ໃນຕົວກາຍພັນ, CNCCs ທີ່ບໍ່ຖືກຈັດໃສ່ໄດ້ເຮັດໃຫ້ຮອຍເປື້ອນເປີດ neural folds (N, P, R).(S–Z) ການວິເຄາະການຕິດສະຫຼາກຂອງ vivo AJ ຢູ່ໃນພາກສ່ວນ coronal ຂອງ WT ແລະ Specc11DTM096/RRH048 embryos ທີ່ມີການກາຍພັນຂອງ E9.5.ຍົນສ່ວນໂດຍປະມານແມ່ນສະແດງຢູ່ມຸມຂວາເທິງ.ຢູ່ໃນພາກສ່ວນຂອງເນື້ອເຍື່ອ mutant, ການ staining ເພີ່ມຂຶ້ນຂອງ F-actin (S, T) ແລະ myosin IIb (U, V) ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນ.ຄ້າຍຄືກັນກັບຜົນໄດ້ຮັບໃນ vitro ໃນຮູບທີ 3, ໃນ embryos mutant, ການປັບປຸງການ staining membrane ສໍາລັບ β-catenin (W, X) ແລະ E-cadherin (Y, Z) ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນ.(AA-BB) ໄມໂຄຣກເອເລັກໂທຣນິກຂອງພາກສ່ວນໜຶ່ງຂອງລູກອ່ອນປະເພດປ່າທີ່ເບິ່ງເກີນຂອບເຂດຂອງເຊນ apical-basal ສະແດງໃຫ້ເຫັນພາກພື້ນທີ່ມີຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງອິເລັກໂທຣນິກທີ່ເຫັນໄດ້ຊັດເຈນຂອງຈຸດເຊື່ອມຕໍ່ຂອງກາວ (AA, ລູກສອນ).ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ໃນພາກສ່ວນຂອງ embryos ທີ່ກາຍພັນ Specc11 (BB, ລູກສອນ), ຈຸດເຊື່ອມຕໍ່ apicobasal ທັງຫມົດແມ່ນມີຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງເອເລັກໂຕຣນິກ, ເຊິ່ງຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງຄວາມຫນາແຫນ້ນທີ່ເພີ່ມຂຶ້ນແລະການກະແຈກກະຈາຍຂອງຈຸດເຊື່ອມຕໍ່ຂອງກາວ.
ເພື່ອທົດສອບການສົມມຸດຕິຖານຂອງພວກເຮົາວ່າການຫຼຸດຊັ້ນແມ່ນເນື່ອງມາຈາກ AJ ທີ່ຖືກປ່ຽນແປງ, ພວກເຮົາໄດ້ກວດເບິ່ງການຕິດສະຫຼາກ AJ ໃນພັບ neural ທີ່ຖືກເປີດເຜີຍຂອງ Specc1l mutant embryos (ຮູບ 5S-Z).ພວກເຮົາໄດ້ສັງເກດເຫັນການເພີ່ມຂື້ນຂອງເສັ້ນໃຍຄວາມກົດດັນ actin (ຮູບ 5S, T) ແລະ concomitant ເພີ່ມຂຶ້ນໃນທ້ອງຖິ່ນຂອງ myosin IIB staining ໃນເສັ້ນໄຍ actin (ຮູບ 5U, V).ສິ່ງສໍາຄັນ, ພວກເຮົາສັງເກດເຫັນການ staining ເພີ່ມຂຶ້ນຂອງ β-catenin (ຮູບ 5W, X) ແລະ E-cadherin (ຮູບ 5Y, Z) ຢູ່ໃນຂອບເຂດ intercellular.ພວກເຮົາຍັງໄດ້ກວດເບິ່ງການເສື່ອມຂອງ β-catenin ຂອງ NCC ໃນ folds neural ຂອງ embryos E8.5 (ຮູບ 5K, L).ການຍັບຍັ້ງ β-catenin ປະກົດວ່າເຂັ້ມແຂງຂຶ້ນໃນ folds neural mutant Specc1l (ຮູບ 5L ແລະ K), ແນະນໍາວ່າການປ່ຽນແປງ AJ ໄດ້ເລີ່ມຕົ້ນ.ໃນ micrographs ເອເລັກໂຕຣນິກຂອງພາກສ່ວນກະໂຫຼກຂອງ E9.5 embryos, ພວກເຮົາອີກເທື່ອຫນຶ່ງສັງເກດເຫັນການແຜ່ກະຈາຍຂອງ electron-dense staining ໃນ Specc1l mutant embryos ເມື່ອທຽບກັບ WT (ຮູບ 5AA, BB ແລະ S1E-H).ປະຕິບັດຮ່ວມກັນ, ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ສະຫນັບສະຫນູນຜົນໄດ້ຮັບ in vitro ຂອງພວກເຮົາໃນຈຸລັງ SPECC1L-kd U2OS ແລະແນະນໍາວ່າ AJ staining ຜິດປົກກະຕິ precedes CNCC stratification ໃນ embryos mutant ຂອງພວກເຮົາ.
ເນື່ອງຈາກການພົວພັນທີ່ເປັນສັດຕູກັນທີ່ຮູ້ຈັກລະຫວ່າງກິດຈະກໍາ AKT ແລະຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງ E-cadherin, 17,28 ພວກເຮົາໄດ້ສົມມຸດຕິຖານການມີສ່ວນຮ່ວມຂອງສັນຍານ PI3K-AKT.ນອກຈາກນັ້ນ, ພວກເຮົາສັງເກດເຫັນຕຸ່ມຜື່ນ subepidermal ໃນບາງຕົວອ່ອນທີ່ກາຍພັນຂອງພວກເຮົາທີ່ຫນີຈາກຄວາມຕາຍ (<5%) ຢູ່ທີ່ E9.5-10.5 ແລະແທນທີ່ຈະຕົກລົງຢູ່ທີ່ປະມານ E13.5 (ຮູບ S3).ໜິ້ວ subepidermal ແມ່ນຈຸດເດັ່ນຂອງສັນຍານ PI3K-AKT ທີ່ຫຼຸດລົງໂດຍອີງໃສ່ PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) ລາຍງານວ່າການຂັດຂວາງການກະຕຸ້ນ PI3K ທີ່ອີງໃສ່ PDGFRα ໃນ PdgfraPI3K/PI3K embryos mutant ສົ່ງຜົນໃຫ້ vesicles subepidermal, ຄວາມບົກຜ່ອງຂອງທໍ່ neural, ແລະ phenotypes palate cleft.ແທ້ຈິງແລ້ວ, ລະດັບຂອງ pan-AKT ແລະ phosphorylated Ser473-AKT ທີ່ມີການເຄື່ອນໄຫວໄດ້ຖືກຫຼຸດລົງໃນ vivo ໃນ Specc1l mutant tissues ກັບ E9.5 embryonic capture (ຮູບ 6A-D).ການຫຼຸດລົງຂອງລະດັບ phosphorylated Ser473-AKT ທັງຫມົດອາດຈະເປັນຍ້ອນການຫຼຸດລົງຂອງລະດັບ pan-AKT ໃນ vivo (ຮູບທີ 6E) ແລະ in vitro (ຮູບທີ 6F).ການຫຼຸດລົງໃນ vitro ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນພຽງແຕ່ໃນເວລາທີ່ຈຸລັງ U2OS ມີຄວາມສອດຄ່ອງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍກັບການປ່ຽນແປງຂອງຮູບຮ່າງຂອງເຊນແລະຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງ AJ (ຮູບ 6D).ດັ່ງນັ້ນ, ຂໍ້ມູນຂອງພວກເຮົາແນະນໍາວ່າ SPECC1L ແມ່ນຕົວຄວບຄຸມທາງບວກໃຫມ່ຂອງສັນຍານ PI3K-AKT ໃນ craniofacial morphogenesis.
(A–E) E8.5 (A,B) ແລະ E9.5 (C,D) skull sections ຫຼື E9.5 lysates ຈາກ Specc1l mutant embryos (E) ສະແດງລະດັບຂອງ phosphorylated S473-AKT ແລະ pan-AKT ການຫຼຸດຜ່ອນທາດໂປຼຕີນ. , ເມື່ອທຽບກັບການຄວບຄຸມ WT.blotting ຕາເວັນຕົກໄດ້ຖືກປະຕິບັດກ່ຽວກັບ lysates ທໍາມະຊາດແລະ lysates mutant ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂດຽວກັນ.ຮູບພາບທີ່ສະແດງສໍາລັບ SPECC1L ໄດ້ຖືກເອົາມາຈາກຫນຶ່ງ blot.blot ດຽວກັນໄດ້ຖືກໂຍກຍ້າຍອອກແລະກວດກາຄືນໃຫມ່ດ້ວຍ anti-pan-ACT ແລະ antibodies β-actin.ລະດັບ Pan-AKT ໃນ E8.5 neural folds (A, B) ແລະລະດັບຂອງ phosphorylated S473-AKT ໃນ E9.5 ພາກສ່ວນກະໂຫຼກໄດ້ຖືກຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ.(F) ລະດັບ Pan-AKT ໄດ້ຖືກຫຼຸດລົງເຊັ່ນດຽວກັນໃນ lysates ຂອງຈຸລັງ SPECC1L-kd U2OS ທີ່ເກັບກ່ຽວຢູ່ທີ່ຈຸດທີ່ສູງ.ແຖບຄວາມຜິດພາດເປັນຕົວແທນຂອງ SEMs ຈາກສາມປະລິມານການແບ່ງແຍກຕາເວັນຕົກເອກະລາດ.(GJ) ພາກສ່ວນຂອງ WT embryos ທີ່ E9.5 stained ດ້ວຍ KI67 ແລະ cleaved caspase 3, ຕາມລໍາດັບ, ສະແດງໃຫ້ເຫັນການຂະຫຍາຍຈຸລັງ (G, G') ແລະກິດຈະກໍາ apoptotic ພຽງເລັກນ້ອຍ (H, H').Specc11 mutant embryos ສະແດງໃຫ້ເຫັນການຂະຫຍາຍຕົວຂອງເຊນທີ່ສົມທຽບ (I), ແຕ່ຈໍານວນຂອງຈຸລັງທີ່ຢູ່ພາຍໃຕ້ການ apoptosis ແມ່ນເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (J).
ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ພວກເຮົາກວດເບິ່ງເຄື່ອງຫມາຍຂອງການຂະຫຍາຍພັນແລະ apoptosis.ພວກເຮົາບໍ່ໄດ້ສັງເກດເຫັນຄວາມແຕກຕ່າງໃດໆໃນການຂະຫຍາຍຕົວຂອງ embryos E9.5 (ຮູບ 6E, G ທຽບກັບ I) ທີ່ມີດັດຊະນີການຂະຫຍາຍຕົວຂອງ 82.5% ສໍາລັບ WT mutants ແລະ 86.5% ສໍາລັບການ mutants Specc1l ວັດແທກໂດຍ KI67 staining (p <0.56, Fisher's ການທົດສອບທີ່ແນ່ນອນ).ເຊັ່ນດຽວກັນ, ພວກເຮົາບໍ່ໄດ້ສັງເກດເຫັນຄວາມແຕກຕ່າງໃດໆຂອງ apoptosis ທີ່ວັດແທກໂດຍການ staining ສໍາລັບ cleaved caspase 3 ໃນ folds neural ຢູ່ E8.5 ຈົນກ່ວາການຈັບຕົວຂອງ embryo (ບໍ່ສະແດງ) (ບໍ່ສະແດງໃຫ້ເຫັນ).ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, apoptosis ແມ່ນເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນທຸກ embryos mutant E9.5 (ຮູບ 6F, H ແລະ J).ການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງ apoptosis ໂດຍລວມນີ້ແມ່ນສອດຄ່ອງກັບການຫຼຸດຜ່ອນສັນຍານ PI3K-AKT ແລະຄວາມຕາຍຂອງ embryonic ຕົ້ນ 29,30,31.
ຕໍ່ໄປ, ເພື່ອຢືນຢັນບົດບາດທີ່ເປັນສາເຫດຂອງສັນຍານ PI3K-AKT ໃນການປ່ຽນແປງ AJ ໃນຈຸລັງ kd ຂອງພວກເຮົາ, ພວກເຮົາປ່ຽນແປງທາງເຄມີໃນການຄວບຄຸມແລະຈຸລັງ kd (ຮູບ 7A-F).ພວກເຮົາໃຊ້ເປັນຕົວຊີ້ບອກ phenotype ການປ່ຽນແປງຮູບຮ່າງຂອງເຊນທີ່ສັງເກດເຫັນຢູ່ໃນຈຸລັງ SPECC1L-kd confluent, ເຊິ່ງພວກເຮົາຄິດໄລ່ໂດຍໃຊ້ອັດຕາສ່ວນຂອງມິຕິທີ່ຍາວທີ່ສຸດ (ຄວາມຍາວ) ກັບມິຕິແນວຕັ້ງ (ຄວາມກວ້າງ).ອັດຕາສ່ວນຂອງ 1 ຄາດວ່າຈະສໍາລັບຈຸລັງທີ່ຂ້ອນຂ້າງຮອບຫຼື cuboidal (ຮູບ 7G).ນອກເຫນືອຈາກຮູບຮ່າງຂອງເຊນ, ພວກເຮົາຍັງໄດ້ຢືນຢັນຜົນກະທົບຂອງ AJ ໂດຍການສີຍ້ອມສີβ-catenin (ຮູບ 7A'-F').ການຍັບຍັ້ງເສັ້ນທາງ PI3K-AKT ໂດຍໃຊ້ wortmannin ແມ່ນພຽງພໍທີ່ຈະປ່ຽນຮູບຮ່າງຂອງເຊນໃນຈຸລັງຄວບຄຸມ (ຮູບ 7A, C) ແລະ AJ (ຮູບ 7A').ຕົວກະຕຸ້ນ PI3K-AKT SC-79 ບໍ່ມີຜົນກະທົບຕໍ່ຮູບຮ່າງຂອງເຊນ (ຮູບ 7A, E) ຫຼືການຂະຫຍາຍ AJ (ຮູບທີ 7A') ໃນຈຸລັງຄວບຄຸມ.ໃນຈຸລັງ SPECC1L-kd, ການສະກັດກັ້ນຕື່ມອີກຂອງເສັ້ນທາງ PI3K-AKT ເຮັດໃຫ້ apoptosis ເພີ່ມຂຶ້ນ (ຮູບ 7B, D) ແລະການເພີ່ມຂື້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນ staining β-catenin (ຮູບ 7B'), ສອດຄ່ອງກັບການ mutants ຫນັກໃນ vivo ຂອງພວກເຮົາ.ສິ່ງສໍາຄັນ, ການເປີດໃຊ້ເສັ້ນທາງ PI3K-AKT ປັບປຸງຮູບຮ່າງຂອງເຊນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (ຮູບ 7B, F) ແລະ AJ phenotypes (ຮູບ 7B”).ການປ່ຽນແປງຂອງຮູບຮ່າງຂອງເຊນໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ເປັນອັດຕາສ່ວນຄວາມຮອບຂອງເຊນ (CCR) ແລະປຽບທຽບກັບຄວາມສໍາຄັນດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍຂ້າງເທິງ (ຮູບທີ 7G).ແທ້ຈິງແລ້ວ, ໃນຈຸລັງຄວບຄຸມ (ຮູບ 7G, CCR = 1.56), ການປິ່ນປົວ wortmannin ແມ່ນພຽງພໍທີ່ຈະປ່ຽນແປງຮູບຮ່າງຂອງເຊນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (ຮູບ 7G, CCR = 3.61, p < 2.4 × 10-9) ໃນຂອບເຂດທີ່ຄ້າຍຄືກັບສິ່ງທີ່ສັງເກດເຫັນ. ໃນ SPECC1L.-kd cells (ຮູບ 7G, CCR = 3.46).ການປິ່ນປົວ Wortmannin ຂອງຈຸລັງ SPECC1L-kd (ຮູບ 7G, CCR = 3.60, negligible) ແມ່ນບໍ່ສໍາຄັນຫຼາຍກ່ວາຈຸລັງ kd ທີ່ບໍ່ມີການປິ່ນປົວ (ຮູບ 7G, CCR = 3.46, negligible) ຫຼືຈຸລັງຄວບຄຸມທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ wortmannin (ຮູບ 7G)., CCR = 3.46, negligible) ນອກຈາກນັ້ນຜົນກະທົບຕໍ່ການຍືດຕົວຂອງເຊນ (7G, CCR = 3.61, negligible).ສິ່ງທີ່ສໍາຄັນທີ່ສຸດ, ຕົວກະຕຸ້ນ SC-79 AKT ໄດ້ຟື້ນຟູ phenotype ຍາວຂອງຈຸລັງ SPECC1L-kd (ຮູບ 7G, CCR = 1.74, p < 6.2 × 10-12).ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ຢືນຢັນວ່າ SPECC1L ຄວບຄຸມສັນຍານ PI3K-AKT ແລະແນະນໍາວ່າການຫຼຸດລົງໃນລະດັບປານກາງຂອງ SPECC1L ມີຜົນກະທົບຕໍ່ການຍຶດຫມັ້ນຂອງເຊນ, ໃນຂະນະທີ່ການຫຼຸດລົງທີ່ເຂັ້ມແຂງເຮັດໃຫ້ apoptosis (ຮູບ 8).
(A–F') ຈຸລັງຄວບຄຸມ (A, C, E) ແລະ SPECC1L-kd (B, D, F) ປິ່ນປົວດ້ວຍ PI3K-AKT pathway inhibitor wortmannin (C, D) ຫຼື SC-79 activator (E, F) .ເຊລຄວບຄຸມທີ່ບໍ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວແມ່ນ cuboidal (A) ທີ່ມີການ staining cellular β-cat ປົກກະຕິ (A'), ໃນຂະນະທີ່ຈຸລັງ kd ຖືກຍືດຍາວ (B) ມີການເສີບ β-cat ເພີ່ມຂຶ້ນ (B').ຫຼັງຈາກການສະກັດກັ້ນເສັ້ນທາງ PI3K-AKT, ຈຸລັງຄວບຄຸມໄດ້ຍືດຕົວ (C) ດ້ວຍການຂະຫຍາຍ β-cat (C'), ໃນຂະນະທີ່ຈຸລັງ kd ເລີ່ມຕົ້ນທີ່ຈະເປັນໂຣກ apoptosis (D), ຄ້າຍຄືກັບ embryos ທີ່ມີການປ່ຽນແປງສູງຂອງພວກເຮົາແລະສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງການເພີ່ມປະສິດທິພາບຂອງ β-cat.staining (D').ຫຼັງຈາກການກະຕຸ້ນຂອງເສັ້ນທາງ PI3K-AKT, ຈຸລັງຄວບຄຸມຍັງຄົງເປັນ cuboidal (E) ແລະມີ staining β-cat (E') ປົກກະຕິ, ໃນຂະນະທີ່ຈຸລັງ kd ສະແດງໃຫ້ເຫັນການປັບປຸງຮູບຮ່າງຂອງເຊນ (F) ແລະ β-cat (F') staining, ຊີ້ບອກ. (G) ລະດັບການປ່ຽນແປງຮູບຮ່າງຂອງເຊນໃນ (AF) ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍໃຊ້ອັດຕາສ່ວນຄວາມຮອບຂອງເຊນ (CCR) ຂອງມິຕິທີ່ຍາວທີ່ສຸດ (ຄວາມຍາວ) ແລະມິຕິແນວຕັ້ງ (ຄວາມກວ້າງ) ທີ່ສອດຄ້ອງກັນໂດຍໃຊ້ຊອບແວ MetaMorph.ເຊລທີ່ບໍ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວ (NT) SPECC1L-kd (CCR = 3.46) ຍາວກວ່າເຊລຄວບຄຸມຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (CCR = 1.56, p < 6.1 × 10–13).ການຍັບຍັ້ງຂອງ wort ຂອງເສັ້ນທາງ PI3K-AKT ໃນຈຸລັງຄວບຄຸມແມ່ນພຽງພໍທີ່ຈະເຮັດໃຫ້ເກີດການຍືດຕົວທີ່ຄ້າຍຄືກັນໃນຮູບຮ່າງຂອງເຊນ (CCR = 3.61, p<2.4 × 10-9).ເຊັ່ນດຽວກັນ, ການກະຕຸ້ນ AKT ໂດຍ SC-79 ໃນຈຸລັງ SPECC1L-kd ຟື້ນຟູການຍືດຕົວຂອງເຊນໄປສູ່ລະດັບການຄວບຄຸມ (CCR = 1.74, p < 6.2 × 10–12).ການປິ່ນປົວ Wortmannin ຂອງຈຸລັງ SPECC1L-kd ສົ່ງຜົນໃຫ້ apoptosis ເພີ່ມຂຶ້ນແຕ່ບໍ່ມີການເພີ່ມຂື້ນຂອງການປ່ຽນແປງຮູບຮ່າງຂອງເຊນ (CCR = 3.60) ເມື່ອທຽບກັບ kd ທີ່ບໍ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວ (CCR = 3.46, ns) ຫຼືຈຸລັງຄວບຄຸມທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ wortmannin (3.61) ສັງເກດເຫັນໃນ .ns = ບໍ່ສໍາຄັນ.+/- ການວັດແທກ SEM ສໍາລັບ 50 ເຊລຖືກສະແດງ.ຄວາມແຕກຕ່າງທາງສະຖິຕິໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍໃຊ້ t-test ຂອງນັກຮຽນ.
(A) Schematic ເປັນຕົວແທນຂອງການຍັບຍັ້ງແລະການກະຕຸ້ນຂອງເສັ້ນທາງ PI3K-AKT ສົ່ງຜົນໃຫ້ AJ ມີການປ່ຽນແປງແລະການກູ້ໄພ, ຕາມລໍາດັບ.(B) ຮູບແບບທີ່ສະເຫນີສໍາລັບການສະຖຽນລະພາບທາດໂປຼຕີນຈາກ AKT ໂດຍ SPECC1L.
CNCCs Premigratory ຕ້ອງການ AJ lysis ເພື່ອແຍກອອກຈາກຈຸລັງ neuroepithelial fold anterior neural 1,15,32.ການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງການ staining ຂອງອົງປະກອບ AJ ແລະການສູນເສຍການແຜ່ກະຈາຍ apical-basal AJ asymmetric ໃນຈຸລັງທີ່ຂາດ SPECC1L ທັງຢູ່ໃນ vitro ແລະໃນ vivo, ສົມທົບກັບຄວາມໃກ້ຊິດທາງດ້ານຮ່າງກາຍຂອງ SPECC1L ກັບ β-catenin, ແນະນໍາວ່າຫນ້າທີ່ SPECC1L ເພື່ອຮັກສາຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງທ້ອງຖິ່ນ AJ ສໍາລັບ ກ້າມເນື້ອອົງການຈັດຕັ້ງ.actin cytoskeleton.ສະມາຄົມຂອງ SPECC1L ກັບ actin cytoskeleton ແລະ β-catenin ແລະການເພີ່ມຂື້ນຂອງຈໍານວນຂອງ actin filaments condensed ໃນກໍລະນີທີ່ບໍ່ມີ SPECC1L ແມ່ນສອດຄ່ອງກັບການເພີ່ມຂື້ນຂອງຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງ AJ.ຄວາມເປັນໄປໄດ້ອີກຢ່າງຫນຶ່ງແມ່ນວ່າການເພີ່ມຂື້ນຂອງເສັ້ນໃຍ actin ໃນຈຸລັງທີ່ຂາດ SPECC1L ນໍາໄປສູ່ການປ່ຽນແປງຂອງຄວາມກົດດັນລະຫວ່າງຈຸລັງ.ເນື່ອງຈາກວ່າຄວາມກົດດັນຂອງ cellular ມີຜົນກະທົບຕໍ່ AJ 33 dynamics, ການປ່ຽນແປງແຮງດັນສາມາດສົ່ງຜົນໃຫ້ AJ 34 ແຜ່ຫຼາຍ.ດັ່ງນັ້ນການປ່ຽນແປງໃດໆຈະມີຜົນກະທົບຕໍ່ຊັ້ນ CNCC.
Wnt1 ແມ່ນສະແດງອອກໃນ folds neural ໃນຕອນຕົ້ນທີ່ເຮັດໃຫ້ເກີດຈຸລັງ neural crest.ດັ່ງນັ້ນ, Wnt1-cre lineage tracing marks ທັງ pre- ແລະ migrating NCC35.ຢ່າງໃດກໍຕາມ, Wnt1 ຍັງເປັນເຄື່ອງຫມາຍ clones ຈຸລັງສະຫມອງ dorsal ຍັງມາຈາກ folds neural ຕົ້ນ 35,36, ເຮັດໃຫ້ມັນເປັນໄປໄດ້ວ່າການ staining ຂອງ E9.5 mutants ຂອງພວກເຮົາສໍາລັບເຄື່ອງຫມາຍ Wnt1 ໃນ folds neural ເປີດບໍ່ແມ່ນ CNCC.ຮອຍເປື້ອນໃນແງ່ບວກຂອງພວກເຮົາສໍາລັບເຄື່ອງໝາຍ NCC AP2A ແລະ SOX10 ໄດ້ຢືນຢັນວ່າ ພັບທາງ neural ທີ່ເປີດເຜີຍຂອງ Specc11 mutant embryos ປະກອບດ້ວຍ CNCC ຢ່າງແທ້ຈິງ.ນອກຈາກນັ້ນ, ນັບຕັ້ງແຕ່ AP2A ແລະ SOX10 ເປັນເຄື່ອງໝາຍຂອງ NCC ທີ່ເຄື່ອນຍ້າຍໄວ, ຮອຍເປື້ອນທາງບວກໄດ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າຈຸລັງເຫຼົ່ານີ້ແມ່ນ CNCC ຫລັງການເຄື່ອນຍ້າຍທີ່ບໍ່ສາມາດຖືກຈັດແບ່ງໂດຍ E9.5.
ຂໍ້ມູນຂອງພວກເຮົາແນະນໍາວ່າລະບຽບການໂມເລກຸນຂອງ AJ ໂດຍ SPECC1L ແມ່ນໄກ່ເກ່ຍໂດຍການສົ່ງສັນຍານ PI3K-AKT.ສັນຍານ AKT ຖືກຫຼຸດລົງໃນຈຸລັງ ແລະເນື້ອເຍື່ອທີ່ຂາດ SPECC1L.ການຄົ້ນຫາໂດຍ Fantauzzo et al.ສະຫນັບສະຫນູນບົດບາດໂດຍກົງສໍາລັບການສົ່ງສັນຍານ PI3K-AKT ໃນ morphogenesis craniofacial.(2014) ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການຂາດການກະຕຸ້ນຂອງສັນຍານ PI3K-AKT ທີ່ອີງໃສ່ PDGFRα ນໍາໄປສູ່ phenotype palate cleft.ພວກເຮົາຍັງສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການຍັບຍັ້ງເສັ້ນທາງ PI3K-AKT ແມ່ນພຽງພໍທີ່ຈະປ່ຽນ AJ ແລະຮູບຮ່າງຂອງເຊນໃນຈຸລັງ U2OS.ສອດຄ່ອງກັບການຄົ້ນພົບຂອງພວກເຮົາ, Cain et al.37 ໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການຫຼຸດລົງຂອງ PI3K α110 subunit ໃນຈຸລັງ endothelial ເຮັດໃຫ້ມີການເພີ່ມຂື້ນທີ່ຄ້າຍຄືກັນໃນ staining pericellular β-catenin, ຫມາຍເຖິງການເພີ່ມຂື້ນຂອງ "ດັດຊະນີການເຊື່ອມຕໍ່".ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ໃນຈຸລັງ endothelial ທີ່ມີ filaments actin ໄດ້ຖືກຈັດຕັ້ງສູງ, ການສະກັດກັ້ນເສັ້ນທາງ PI3K-AKT ສົ່ງຜົນໃຫ້ມີຮູບຮ່າງຂອງເຊນວ່າງ.ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ເຊລ SPECC1L-kd U2OS ສະແດງໃຫ້ເຫັນຮູບຮ່າງຂອງເຊລທີ່ຍາວອອກ.ຄວາມແຕກຕ່າງນີ້ອາດຈະເປັນປະເພດເຊນສະເພາະ.ໃນຂະນະທີ່ການສະກັດກັ້ນການສົ່ງສັນຍານ PI3K-AKT ຢ່າງຖາວອນຜົນກະທົບຕໍ່ cytoskeleton actin, ຜົນກະທົບຂອງຮູບຮ່າງຂອງເຊນແມ່ນຖືກກໍານົດໂດຍການປ່ຽນແປງຄວາມກົດດັນທີ່ເກີດຈາກການປ່ຽນແປງຂອງຄວາມຫນາແຫນ້ນແລະການຈັດຕັ້ງຂອງເສັ້ນໃຍ actin ກາງ.ໃນເຊລ U2OS, ພວກເຮົາໃຊ້ພຽງແຕ່ການປ່ຽນແປງຮູບຮ່າງຂອງເຊນເປັນເຄື່ອງໝາຍຂອງການປ່ຽນແປງ ແລະການຟື້ນຟູ AJ ທີ່ຂາດ SPECC1L.ສະຫຼຸບແລ້ວ, ພວກເຮົາສົມມຸດວ່າການຍັບຍັ້ງຂອງເສັ້ນທາງ AKT ໃນການຂາດແຄນ SPECC1L ເພີ່ມຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງ AJ ແລະຫຼຸດຜ່ອນ delamination ໃນ CNCC.
ຫນ້າສົນໃຈ, ລະດັບ pan-AKT ໄດ້ຖືກຫຼຸດລົງໃນ vitro ແລະ in vivo ນອກເຫນືອຈາກລະດັບ phosphorylated 473-AKT ໃນກໍລະນີທີ່ບໍ່ມີ SPECC1L, ແນະນໍາລະບຽບການຂອງສັນຍານ PI3K-AKT ໃນລະດັບຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ AKT ຫຼືການປ່ຽນແປງ.genes SPECC1L ແລະ MID1, ທັງສອງທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບໂຣກ Opitz/GBBB, ເຂົ້າລະຫັດໂປຣຕີນທີ່ເຮັດໃຫ້ microtubules ສະຖຽນລະພາບ 18,22 .ກົນໄກທີ່ SPECC1L ແລະ MID1 mediate ສະຖຽນລະພາບ microtubule ແມ່ນບໍ່ເຂົ້າໃຈຢ່າງເຕັມສ່ວນ.ໃນກໍລະນີຂອງ SPECC1L, ສະຖຽນລະພາບນີ້ປະກອບມີ acetylation ປັບປຸງຂອງຊຸດຍ່ອຍຂອງ microtubules 18 .ມັນເປັນໄປໄດ້ວ່າ SPECC1L ໃຊ້ກົນໄກທີ່ຄ້າຍຄືກັນເພື່ອສະຖຽນລະພາບຂອງທາດໂປຼຕີນອື່ນໆເຊັ່ນ AKT.ມັນໄດ້ຖືກສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ acetylation ຂອງ lysine residues ໃນທາດໂປຼຕີນຈາກ AKT ນໍາໄປສູ່ການຫຼຸດລົງຂອງການທ້ອງຖິ່ນຂອງເຍື່ອແລະ phosphorylation38.ນອກຈາກນັ້ນ, ການແຜ່ກະຈາຍຂອງລະບົບຕ່ອງໂສ້ K63 ຢູ່ບ່ອນດຽວກັນກັບ lysine residue ໃນ AKT ແມ່ນຈໍາເປັນສໍາລັບການທ້ອງຖິ່ນຂອງເຍື່ອຂອງມັນແລະການເປີດໃຊ້ງານ39,40.ໃນບັນດາປັດໃຈຈໍານວນຫນຶ່ງທີ່ພົວພັນກັບທາດໂປຼຕີນຈາກ SPECC1L ທີ່ຖືກລະບຸໄວ້ໃນຫນ້າຈໍສອງລູກປະສົມທີ່ມີເຊື້ອລາຫຼາຍຊະນິດ, ສີ່ - CCDC841, ECM2942, APC ແລະ UBE2I43 - ມີຄວາມກ່ຽວຂ້ອງກັບການຫັນປ່ຽນຂອງທາດໂປຼຕີນຫຼືຄວາມຫມັ້ນຄົງໂດຍຜ່ານການ ubiquitination ຫຼື suoylation.SPECC1L ອາດຈະມີສ່ວນຮ່ວມໃນການດັດແກ້ຫລັງການແປຂອງ residues AKT lysine, ຜົນກະທົບຕໍ່ຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງ AKT.ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ບົດບາດສໍາຄັນຂອງ SPECC1L ໃນການທ້ອງຖິ່ນແລະຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ AKT ຍັງຄົງໄດ້ຮັບການອະທິບາຍ.
ຂໍ້ບົກພ່ອງຮ້າຍແຮງຂອງການສະແດງອອກ SPECC1L ໃນ vivo ເຮັດໃຫ້ມີການເສື່ອມຂອງເຄື່ອງຫມາຍ AJ ເພີ່ມຂຶ້ນແລະການວາງຊ້ອນ CNCC ຜິດປົກກະຕິ, ເຊັ່ນດຽວກັນກັບການເພີ່ມ apoptosis ແລະຄວາມຕາຍຂອງ embryonic ຕົ້ນ.ບົດລາຍງານທີ່ຜ່ານມາໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ mutants ຫນູທີ່ມີລະດັບເພີ່ມຂຶ້ນຂອງ apoptosis ແມ່ນກ່ຽວຂ້ອງກັບຄວາມຜິດປົກກະຕິຂອງທໍ່ neural 44,45,46,47 ແລະ craniofacial defects48.ມັນໄດ້ຖືກແນະນໍາວ່າການຕາຍຂອງເຊນຫຼາຍເກີນໄປໃນ folds neural ຫຼື arches pharyngeal ອາດຈະເຮັດໃຫ້ຈໍານວນຈຸລັງບໍ່ພຽງພໍສໍາລັບການເຄື່ອນໄຫວ morphogenetic ທີ່ເຫມາະສົມ 48,49,50.ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ເສັ້ນຈຸລັງທີ່ຂາດແຄນ SPECC1L ຂອງພວກເຮົາທີ່ມີການສະແດງອອກ SPECC1L ຫຼຸດລົງປານກາງສະແດງໃຫ້ເຫັນການປ່ຽນແປງ AJ ເທົ່ານັ້ນໂດຍບໍ່ມີຫຼັກຖານຂອງການເສຍຊີວິດຂອງເຊນເພີ່ມຂຶ້ນ.ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ການຍັບຍັ້ງທາງເຄມີຂອງເສັ້ນທາງ PI3K-AKT ໃນຈຸລັງ Kd ເຫຼົ່ານີ້ເຮັດໃຫ້ apoptosis ເພີ່ມຂຶ້ນ.ດັ່ງນັ້ນ, ການຫຼຸດລົງປານກາງຂອງການສະແດງອອກຫຼືຫນ້າທີ່ SPECC1L ຮັບປະກັນການຢູ່ລອດຂອງເຊນ.ນີ້ແມ່ນສອດຄ່ອງກັບການສັງເກດການທີ່ຫາຍາກ Specc11 embryos mutant ທີ່ຫນີການຈັບກຸມຢູ່ st.E9.5—ບາງທີອາດເປັນຍ້ອນປະສິດທິພາບການຈັບຕົວຂອງ gene ຫຼຸດລົງ—ສາມາດປິດທໍ່ປະສາດຂອງພວກມັນ ແລະຢຸດເຊົາການພັດທະນາໃນພາຍຫຼັງ, ມັກຈະມີຂໍ້ບົກພ່ອງຂອງ craniofacial (ຮູບ S3).ນອກຈາກນີ້ຍັງສອດຄ່ອງກັບນີ້ແມ່ນການປະກົດຕົວທີ່ຫາຍາກຂອງ embryos heterozygous Specc1l ທີ່ມີຄວາມຜິດປົກກະຕິ craniofacial - ອາດຈະເປັນຍ້ອນການເພີ່ມປະສິດທິພາບການຈັບຂອງ gene - ເຊັ່ນດຽວກັນກັບການຄົ້ນພົບໃນ zebrafish ເຊິ່ງຫນຶ່ງໃນສອງ SPECC1L orthologues (specc1lb) ເຮັດໃຫ້ເກີດ phenotypes ຂອງ embryonic ຊ້າ, ລວມທັງການສູນເສຍ. ຄາງກະໄຕລຸ່ມ ແລະຮອຍແຕກສອງຝ່າຍ51.ດັ່ງນັ້ນ, ການກາຍພັນຂອງການສູນເສຍຫນ້າທີ່ຂອງ heterozygous SPECC1L ທີ່ຖືກກໍານົດຢູ່ໃນຄົນເຈັບຂອງມະນຸດອາດຈະເຮັດໃຫ້ເກີດຄວາມບົກຜ່ອງເລັກນ້ອຍໃນການເຮັດວຽກຂອງ SPECC1L ໃນລະຫວ່າງການ morphogenesis craniofacial, ພຽງພໍທີ່ຈະອະທິບາຍຮອຍແຕກຂອງ orofacial ຂອງເຂົາເຈົ້າ.ລະບຽບການທີ່ອີງໃສ່ SPECC1L ຂອງການຕິດຕໍ່ intercellular ຍັງອາດຈະມີບົດບາດໃນ palatogenesis ແລະ fusion ຂອງ arches pharyngeal ໄດ້.ການສຶກສາເພີ່ມເຕີມຂອງຫນ້າທີ່ SPECC1L ຈະຊ່ວຍອະທິບາຍບົດບາດຂອງການຕິດຕໍ່ intercellular ຊົ່ວຄາວໃນ CNCC ໃນລະຫວ່າງການປິດທໍ່ neural ໃນການເຄື່ອນໄຫວຂອງຈຸລັງ neuroepithelial ແລະ morphogenesis craniofacial.
ການຄວບຄຸມ osteosarcoma U2OS ແລະຈຸລັງ SPECC1L-kd ໄດ້ຖືກອະທິບາຍກ່ອນຫນ້ານີ້ (Saadi et al., 2011).ພູມຕ້ານທານຕໍ່ກັບ SPECC1L ຍັງມີລັກສະນະກ່ອນໜ້ານີ້ (Saadi et al., 2011).Anti-β-catenin antibodies (rabbit; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (ຫນູ; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), myosin IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego. , California), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), cleaved caspase 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) ແລະ β-actin (1:2500; Sigma-Aldrich, St. MO ) ຖືກ​ນໍາ​ໃຊ້​ຕາມ​ທີ່​ອະ​ທິ​ບາຍ​..ເສັ້ນໃຍ Actin ຖືກຍ້ອມດ້ວຍ Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
ຈຸລັງຄວບຄຸມ U2OS ແລະຈຸລັງ SPECC1L-kd ໄດ້ຖືກປູກຝັງຢູ່ໃນມາດຕະຖານ glucose DMEM ສູງທີ່ເສີມດ້ວຍ serum bovine fetal 10% (Life Technologies, Carlsbad, CA).ສໍາລັບການປ່ຽນແປງຂອງ AJ, ຈຸລັງ 2 x 105 ໄດ້ຖືກແກ່ນໃສ່ແກ້ວທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ 0.1% porcine gelatin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ແລະສັງເກດເຫັນການປ່ຽນແປງຂອງຮູບຮ່າງຂອງເຊນ.ຈຸລັງໄດ້ຖືກເກັບກໍາຢູ່ໃນຈຸດເວລາທີ່ຊີ້ໃຫ້ເຫັນທີ່ແຕກຕ່າງກັນ: 4 ຊົ່ວໂມງຫຼັງຈາກແກ່ນ (t = 1), 24 ຊົ່ວໂມງຫຼັງຈາກແກ່ນ (t = 2), confluence ໂດຍບໍ່ມີການປ່ຽນແປງໃນຮູບຮ່າງຂອງເຊນ (t = 3), ການປ່ຽນແປງໃນຮູບຮ່າງຂອງເຊນ (t = 4) , 24 h ຫຼັງຈາກການປ່ຽນແປງຮູບຮ່າງຂອງເຊນ (t = 5) ແລະ 48 h ຫຼັງຈາກການປ່ຽນແປງຮູບຮ່າງຂອງເຊນ (t = 6) (ຮູບ 1, 2, 3).ເພື່ອປັບປ່ຽນເສັ້ນທາງ PI3K-AKT, ຈຸລັງໄດ້ຖືກຝັງຢູ່ໃນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນທີ່ລະບຸໄວ້ດ້ວຍ PI3K-AKT inhibitor wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) ຫຼື SC-79 activator (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).ຂະຫນາດກາງທີ່ມີສານເຄມີໄດ້ຖືກປ່ຽນປະຈໍາວັນ.
ການບັນທຶກແບບກອບແຕ່ລະເຟຣມຖືກສ້າງຂື້ນໃນການຄວບຄຸມສົດໆ ແລະເຊລ KD ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂວັດທະນະທໍາປົກກະຕິ, ແລະຮູບພາບຄວາມຄົມຊັດຂອງໄລຍະໄດ້ຖືກເກັບກໍາທຸກໆ 10 ນາທີເປັນເວລາ 7 ມື້.ຮູບພາບໄດ້ມາໂດຍໃຊ້ກ້ອງຈຸລະທັດປີ້ນກັບ Leica DM IRB ທີ່ຄວບຄຸມດ້ວຍຄອມພິວເຕີພ້ອມດ້ວຍຂັ້ນຕອນກົນຈັກ ແລະຈຸດປະສົງ 10 × N-PLAN ທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ກັບກ້ອງ QImaging Retiga-SRV.ໃນ​ລະ​ຫວ່າງ​ການ​ຖ່າຍ​ຮູບ, ວັດ​ທະ​ນະ​ທໍາ​ຂອງ​ເຊ​ລ​ໄດ້​ຖືກ​ຮັກ​ສາ​ໄວ້​ທີ່ 37 ° C ໃນ​ບັນ​ຍາ​ກາດ​ຊຸ່ມ​ຊື່ນ​ທີ່​ມີ 5% CO2.
ສອງ gene trap ES cell line DTM096 ແລະ RRH048 ຈາກ Regional Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອສ້າງເສັ້ນຫນູທີ່ຂາດສານ Specc11, ກໍານົດ Specc1lgtDTM096 ແລະ Specc1lgtRRH046.ໂດຍຫຍໍ້, ຈຸລັງ 129/REJ ES ຖືກສີດເຂົ້າໄປໃນ C57BL6 blastocysts.ຜົນໄດ້ຮັບຂອງຫນູຜູ້ຊາຍ chimeric ໄດ້ຖືກປະສົມພັນກັບຫນູ C57BL6 ເພດຍິງເພື່ອກໍານົດ offspring ທີ່ມີສີເປືອກຫຸ້ມນອກ agouti.ການປະກົດຕົວຂອງຕົວແຊກ vector ກັບດັກ gene ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກໍານົດ heterozygotes.ໜູຖືກເກັບຮັກສາໄວ້ໃນພື້ນຫຼັງປະສົມຂອງ 129/REJ;C57BL6.ສະຖານທີ່ຂອງການແຊກຊຶມຂອງ vector ກັບດັກພັນທຸກໍາໄດ້ຖືກຢືນຢັນໂດຍ RT-PCR, ການຈັດລໍາດັບ genome, ແລະການເສີມພັນທຸກໍາ (ຮູບເພີ່ມເຕີມ 1).ເພື່ອຕິດຕາມສາຍພັນ CNCC ຂອງໜູຄູ່ Specc1lGT heterozygous, ROSAmTmG (#007576) ແລະ Wnt1-Cre (#003829) ໜູ (ຫ້ອງທົດລອງ Jackson, Bar Harbor, ME) ໄດ້ຖືກຂ້າມໄປຜະລິດ ROSAmTmG ແລະ Wnt1-Cre allele mullele ໃນ Speccem.ການທົດລອງທັງໝົດໃນໜູໄດ້ຖືກປະຕິບັດຕາມພິທີການທີ່ໄດ້ຮັບການອະນຸມັດໂດຍຄະນະກຳມາທິການການດູແລ ແລະນຳໃຊ້ສັດຂອງສະຖາບັນການແພດຂອງມະຫາວິທະຍາໄລ Kansas.
Embryos ໄດ້ຖືກແກ້ໄຂໃນ (1% formaldehyde, 0.2% glutaraldehyde, 2 mM MgCl2, 0.02% NP-40, 5 mM EGTA) ສໍາລັບ 60 ນາທີໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ.ຫຼັງຈາກການສ້ອມແຊມໃນການແກ້ໄຂການຍ້ອມສີ X-gal (5 mM potassium ferricyanide, 5 mM potassium ferrocyanide, 2 mM MgCl2, 0.01% sodium deoxycholate, 0.02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) ການພັດທະນາຮອຍເປື້ອນໄດ້ຖືກປະຕິບັດຢູ່ທີ່ 37 ° C. .°C ພາຍໃນ 1-6 ຊົ່ວໂມງ.Embryos ໄດ້ຖືກແກ້ໄຂຫຼັງໃນ 4% PFA ແລະເບິ່ງເຫັນພາບ.
ສໍາລັບການ blotting ຕາເວັນຕົກ, ຈຸລັງໄດ້ຖືກ lysed ໃນ passive lysis buffer (Promega, Fitchburg, WI) ເສີມດ້ວຍປະສົມຂອງ HALT protease inhibitors (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lysates ໄດ້ຖືກປຸງແຕ່ງຢູ່ໃນ 12% polyacrylamide Mini-PROTEAN TGX gels ພ້ອມທີ່ຈະເຮັດ (Bio-Rad, Hercules, CA) ແລະໂອນເຂົ້າໄປໃນເຍື່ອ Immobilon PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA).ເຍື່ອໄດ້ຖືກສະກັດຢູ່ໃນນົມ 5% ໃນ PBS ທີ່ມີ 0.1% Tween.ພູມຕ້ານທານໄດ້ຖືກອົບໃນຄືນຢູ່ທີ່ 4 ° C ຫຼືເປັນເວລາຫນຶ່ງຊົ່ວໂມງໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ.Femto SuperSignal West ECL reagent (Thermo Scientific, Waltham, MA) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການສ້າງສັນຍານ.ສໍາລັບ immunostaining, embryos ໄດ້ຖືກສ້ອມແຊມຄືນໃນ 4% PFA / PBS ແລະ cryopreserved.ການແຊ່ແຂງຂອງເນື້ອເຍື່ອໄດ້ຖືກສະກັດຢູ່ໃນ PBS ທີ່ປະກອບດ້ວຍ 1% serum ແບ້ປົກກະຕິ (Thermo Scientific, Waltham, MA) ແລະ 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນ incubated ຢູ່ທີ່ 4 ° C ໃນ incubator ໃນໄລຍະການ. ກາງຄືນ.ດ້ວຍສານຕ້ານອະນຸມູນອິດສະລະ ແລະ ພູມຕ້ານທານຂັ້ນສອງ fluorescent (1:1000) ເປັນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງທີ່ອຸນຫະພູມ 4°C.ພາກສ່ວນທີ່ມີຮອຍເປື້ອນໄດ້ຖືກຈັດໃສ່ໃນຂະຫນາດກາງຄໍາ ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) ແລະຮູບພາບຮາບພຽງໄດ້ຮັບໂດຍໃຊ້ກ້ອງຈຸລະທັດ Leica TCS SPE confocal.ແຕ່ລະ immunostaining ໄດ້ຖືກປະຕິບັດເປັນສາມການທົດລອງເອກະລາດກ່ຽວກັບການ cirossections ຂອງຢ່າງຫນ້ອຍສອງ embryos mutant.ການທົດລອງຕົວແທນສະແດງໃຫ້ເຫັນ.
ຈຸລັງຖືກອົບຢູ່ໃນ RIPA buffer ທີ່ຖືກດັດແປງ (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% glycerol, 2 mM EDTA, ແລະ HALT protease inhibitor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ໂດຍຫຍໍ້, lysates ໄດ້ຖືກ prepurified ດ້ວຍທາດໂປຼຕີນ G magnetic beads (Life Technologies, Carlsbad, CA) ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນ incubated ຄືນຢູ່ 4 ° C. ດ້ວຍ anti-SPECC1L ຫຼື IgG ທາດໂປຼຕີນຈາກ beads ທາດໂປຼຕີນຈາກ G ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອສະກັດ SPECC1L ແລະການ blotting ຕາເວັນຕົກໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍຕ້ານການ. -β-catenin ພູມຕ້ານທານທີ່ອະທິບາຍຂ້າງເທິງ ການທົດລອງຮ່ວມ IP ທີ່ສະແດງໃຫ້ເຫັນແມ່ນຕົວແທນຂອງສີ່ການທົດລອງເອກະລາດ.
ຈຸລັງລ້ຽງສັດທີ່ຄົງທີ່ ຫຼືເນື້ອເຍື່ອຝັງຕົວຂອງໜູໄດ້ຖືກສະໜອງໃຫ້ສູນກ້ອງຈຸລະທັດເອເລັກໂຕຣນິກຢູ່ສູນການແພດມະຫາວິທະຍາໄລ Kansas.ໂດຍຫຍໍ້, ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກຝັງຢູ່ໃນ EMbed 812 resin (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), polymerized ຄືນຢູ່ທີ່ 60 ° C, ແລະແບ່ງອອກຢູ່ທີ່ 80 nm ໂດຍໃຊ້ Leica UC7 ultramicrotome ທີ່ມີໃບເພັດ.ພາກສ່ວນຕ່າງໆໄດ້ຖືກເບິ່ງເຫັນໂດຍໃຊ້ກ້ອງຈຸລະທັດອີເລັກໂທຣນິກສາຍສົ່ງ JEOL JEM-1400 ທີ່ມີປືນ 100 kV Lab6.
ວິທີການອ້າງເຖິງບົດຄວາມນີ້: Wilson, NR et al.ການຂາດສານ SPECC1L ນໍາໄປສູ່ຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງຂໍ້ຕໍ່ spliced ​​ເພີ່ມຂຶ້ນແລະການຫຼຸດຜ່ອນ delamination ຂອງຈຸລັງ neural crest cranial.ວິທະຍາສາດ.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.induction ແລະຄວາມແຕກຕ່າງຂອງ crest neural ໄດ້.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.ຈຸລັງ cranial neural crest ໃນການເຄື່ອນໄຫວ: ພາລະບົດບາດຂອງເຂົາເຈົ້າໃນການພັດທະນາ craniofacial.American Journal of Medical Genetics.ສ່ວນ A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: ການຂະຫຍາຍຕົວແລະການພັດທະນາຂອງມັນໃນໄລຍະ 20 ປີ.ແພດເດັກ.ພະຍາດວິທະຍາ.ຫ້ອງທົດລອງ.​ຢາ.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU ແລະ Noten MM Breakthrough ໃນພັນທຸກໍາຂອງ orofacial clefts.ແນວໂນ້ມຂອງຢາໂມເລກຸນ 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. ແລະ Riley, FM ກົນໄກໂມເລກຸນຂອງການເຄື່ອນຍ້າຍຂອງເຊນ neural crest cranial ແລະຮູບແບບໃນລະຫວ່າງການພັດທະນາ craniofacial.ການພັດທະນາ 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH ແລະ Murray, JK Cleft lip and palate: ຄວາມເຂົ້າໃຈກ່ຽວກັບພັນທຸກໍາແລະສິ່ງແວດລ້ອມ.ຄໍາ​ເຫັນ​ທໍາ​ມະ​ຊາດ​.ພັນທຸ ກຳ 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.morphogenesis ຜິດປົກກະຕິຂອງຜິວຫນັງ, ແຂນຂາ, ແລະພາກພື້ນ craniofacial ໃນຫນູທີ່ຂາດສານ interferon-regulating factor-6 (Irf6).Genette ແຫ່ງຊາດ.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.ການກາຍພັນທີ່ເດັ່ນຊັດໃນ GRHL3 ເຮັດໃຫ້ເກີດໂຣກ van der Waord ແລະເຮັດໃຫ້ການພັດທະນາຂອງ periderm ຂອງປາກຫຼຸດລົງ.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ ແລະ Juriloff, DM ປັບປຸງບັນຊີລາຍຊື່ຂອງ mutants ຫນູທີ່ມີຂໍ້ບົກພ່ອງໃນການປິດທໍ່ neural ແລະກ້າວໄປສູ່ຄວາມເຂົ້າໃຈທາງພັນທຸກໍາທີ່ສົມບູນຂອງການປິດທໍ່ neural.ການ​ສືບ​ສວນ​ຂອງ​ຄວາມ​ຜິດ​ປົກ​ກະ​ຕິ​ການ​ເກີດ​.ພາກທີ A, ຄລີນິກ ແລະ ໂມເລກຸນ Teratology 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through a p53-dependent intracellular pathway.ການພັດທະນາພັນທຸກໍາ 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND ແລະ Murdoch, JN Disheveled: ຄວາມສໍາພັນຂອງການຂະຫຍາຍຕົວ convergent ກັບການປິດທໍ່ neural.ແນວໂນ້ມໃນລະບົບປະສາດ.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).